Получение и идентификация полиплоидных форм растений

---

1.

Тетраплоидные сорта ржи, клевера, гречихи, турнепса и некоторых других культур, а также триплоидные гибриды сахарной свеклы широко используются в производстве. Ведется работа по созданию хозяйственно ценных полиплоидных форм других растений. Чаще всего для получения полиплоидов используют колхицин, так как он обеспечивает большой процент полиплоидных форм у всех сельскохозяйственных культур.

Раствором колхицина воздействуют либо на сухие, наклюнувшиеся и проросшие семена, либо на точки роста растений более позднего возраста.

Известно множество приемов обработки колхицином. Они раз­личаются по концентрации раствора, экспозиции и технике воздей­ствия.

У ржи тетраплоиды можно получать, воздействуя на сухие или наклюнувшиеся семена. Заранее приготовленный маточный раствор колхицина концентрации 1—2 % (его нужно хранить в темном ме­сте) разводят до концентрации 0,01—1 %, заливают сухие семена поместив их в стеклянную емкость, и оставляют на срок от 3 ч до 3 сут (чем больше концентрация, тем меньше экспозиция). По исте­чении этого времени раствор сливают, а емкость с семенами под­ставляют под струю водопроводной воды для отмывки семян от ра­створа. Затем их высевают.

Можно воздействовать колхицином на наклюнувшиеся семена. Их завязывают в марлевый узелок и подвешивают под струю водопроводной воды на 3—4 ч, а затем оставляют в узелке на сутки при комнатной температуре, после чего обрабатывают колхицином, как описано выше.

Описанные способы просты, но они связаны с повреждением корневой системы, которая особенно чувствительна к колхицину. Этого можно избежать, если воздействовать на точки роста, изоли­ровав корневую систему от попадания на нее раствора колхицина.

При работе с рожью применяют следующий способ. Наклюнувшиеся семена раскладывают на мелкоячеистую металлическую сетку. Сетку помещают в емкость, наполненную водой так, чтобы уровень ее смачивал нижнюю поверхность сетки. Сверху емкость закрывают стеклом для создания влажной камеры. Когда корешки достигнут длины 1—1,5 см и семена хорошо укрепятся на сетке, ее вынимают, переворачивают вверх корнями и опускают ростками в раствор колхицина. Корни должны быть вне раствора. Чтобы они не высыхали, нужно поместить их во влажную камеру. Хорошие результаты дает выдерживание в 0,2 %-ном растворе колхицина в течение 16—24 ч. Затем сетку с проростками переносят в кювету и возвращают в исходное положение. Кювету ставят под струю водопроводной воды на 2—3 ч для отмывки. В кювете проростки выдерживают сутки на воде или растворе Кнопа, после чего проростки с утолщенным (но не чрезмерно) гипокотилем, что является косвен­ным признаком полиплоидных форм, высаживают в ящики или ва­зоны, наполненные смесью почвы и песка. Через 2—3 нед ящики помещают в камеру для яровизации (при —1 °С) на 60 дней. Затем растения в тех же ящиках оставляют до созревания.

Сходный способ применяется для получения полиплоидов у клевера, только его семена сразу проращивают в чашках Петри на фильтровальной бумаге., которая, играет роль сетки. На 4—5-й день после начала проращивания фильтровальную бумагу вместе с проростками переносят в другую чашку Петри с раствором колхицина (0,2—0,25 %). В раствор опускают семядоли (экспозиция — 16 ч). После отмывки (достаточно трижды залить проростки водой и слить ее) проростки оставляют на фильтровальной бумаге в чашке Петри еще на 10 дней, после чего пересаживают в ящики с почвой. Пере­саживают только проростки с разросшимися темно-зелеными семя­долями. Через месяц, когда образуется розетка, растения с при­знаками тетраплоидов высаживают в поле.

При работе с другими объектами часто применяют капельный метод. Он состоит в том, что капли раствора колхицина периодиче­ски наносят на точки роста. Можно добавлять в раствор агар или камедь трагакантового астрагала (растение из семейства бобовые) — трагакант: в этом случае капли меньше растекаются. Трагакант после высыхания обладает свойством вторично набухать под дей­ствием влаги (росы, полива), что продлевает действие колхицина.

У сахарной: свеклы большой выход тетраплоидов дает обработка всходов в фазе «вилочки». Обработку ведут в теплице при температу­ре 15—20 °С и относительн9Й влажности воздуха 60—80 %. Семена высевают в ящики. На- 6—ГО-й день приступают в обработке. Глаз- ной пипеткой на проростки каждые 2—3 ч (в дневное время) наносят каплю раствора колхицина 0,2 %-ной концентрации. Обработку ведут в течение 12—20 дней. Семядоли под воздействием обработки утолщаются, первая и вторая пары листьев угнетаются, появление их задерживается. При сильном угнетении делают перерыв на Л—4 сут: обработку колхицином временно; прекращают. Примерно через месяц после окончания обработки растения, имеющие призна­ки тетраплоидов, высаживают в поле.

У свеклы второго года жизни оставляют 2—3 наиболее мощных цветоносных побега, остальные удаляют. Эту операцию проводят в самом начале вегетации. Когда оставленные побеги достигнут 6—8 см, начинают обработку. Готовят 0,3 %-ный раствор колхицина в 0,4 %-ном водном растворе агара. Раз в сутки наносят его на точки роста побегов. Растения выращивают, притеняя их (напри­мер, натянутой на каркасе марлей). Обработку прекращают, когда завершится рост побегов. Если побеги сильно угнетаются, делают перерыв. Удаляют вновь появляющиеся побеги.

Во всех случаях, во время обработки колхицином и пока расте­ния еще не окрепли, их следует выдерживать при рассеянном свете. При работе с колхицином нужно соблюдать осторожность, работать в резиновых перчатках, не допуская попадания раствора на кожу.

В год обработки колхицином возникают, как правило, химерные по плоидности растения, а значит, различные по плоидности семена. Задача состоит в том, чтобы выбрать растения, имеющие наибольшее количество тетраплоидных клеток. Для этого используют косвенные признаки. Контроль по косвенным признакам в необходимых слу­чаях дополняют цитологическим контролем.

Контроль за плоидностью должен быть многократным, так как в химерных по плоидности тканях- диплоидные участки могут вы­теснять тетраплоидные. Тетраплоидные растения обычно имеют бо­лее короткие междоузлия, более широкие и толстые листовые пла­стинки темно-зеленого цвета, более крупные цветки и плоды, у них часто проявляется махровость цветка. Хорошими диагностическими признаками служат длина и ширина замыкающих клеток устьиц, число хлоропластов в них, размер пыльцевых зерен и количество пор в них. У тетраплоидов все эти показатели выше, чем у диплоидов. Выбор наиболее эффективного диагностического признака зависит от объекта.

У ржи в год обработки колхицином, помимо утолщенного гипокотиля, признаками полиплоидности служат широкий темно-зеленый лист с крупной широкой лигулой, крупная двухпоровая пыль­ца (у гаплоидных пыльцевых зерен — одна пора), более крупные семена.

У клевера растения с преобладанием тетраплоидных тканей име­ют крупные толстые темно-зеленые семядоли, утолщенные черешки листьев. Листья темно-зеленые, часто гофрированные. Опушение более редкое, но длинное и поэтому очень заметное. Пыльцевые зер­на округло-угловатые в отличие от овальных у диплоидов.

При обработке колхицином сахарной свеклы в фазе «вилочки» первый отбор по особенностям листьев ведут при высадке растений в поле, второй, также по морфологическим признакам,— после приживания растений, третий — цитологическими методами (пре­параты готовят из листьев). На следующий год у высадков цвето­носные побеги контролируют по числу хлоропластов (оно достигает у тетраплоидов 24—25 против 13—15 у диплоидов). Диплоидные побеги удаляют. Затем ведут цитологический контроль. Оставляют растения (побеги), имеющие не менее 70—80 % тетраплоидных клеток.

При обработке колхицином сахарной свеклы 2-го года жизни тетраплоидные побеги выявляют, просматривая пыльцу и определяя число пор в экзине (у тетраплоидов оно в 2,5 раза больше). Остав­ляют те побеги, где диплоидная пыльца составляет не менее 90— 95 %.

Окончательно выделяют тетраплоиды в С₁ (растения, выросшие из семян, полученных на обработанных растениях). У ржи и сахар­ной свеклы применяют цитологический контроль. У ржи для этой цели можно использовать корешки проростков, у сахарной свек­лы — молодые листья. У клевера форма пыльцевых зерен — на­столько надежный диагностический признак, что к цитологическому контролю можно не прибегать.

Контрольные вопросы

1. По каким показателям идентифицируется полиплоиды

2. Какой способ применяют при работе с рожью

3. Выбор наиболее эффективного диагностического признака зависит от

2. Получение и отбор мутантных форм растений

Экспериментальный мутагенез как метод получения ценных форм сельскохозяйственных растений прочно вошел в селекционную практику. Используют как физические, так и химические мутагены. В качестве физических мутагенов чаще всего применяют ионизирую­щее излучение: гамма, рентгеновское и быстрые нейтроны. Сами селекционеры облучением не занимаются. Его проводят специа­листы-физики. Удобнее всего облучать сухие семена. Для различ­ных культур рекомендуют разные дозы облучения. Они должны быть на 15—20 % ниже критических.

Дозы быстрых нейтронов в 10—20 раз меньше (выражают их в единицах поглощенной энергии — греях). После воздействия рентгеновским и гамма-излучением или быстрыми нейтронами семе­на можно сразу высевать.

В качестве химических мутагенов используют этиленимин, этилметансульфонат, гидроксиламин, нитрозоэтилмочевину, нитрозометилмочевину, диэтилсульфат, 1,4-бисдиазоацетилбутан и некото­рые другие. Их применяют в малых концентрациях — от 0,0001 до 3 %.

Таблица 11- Критические дозы для облучения рентгеновским и гамма-излучением сухих семян некоторых сельскохозяйственных культур

* В единицах СИ —кулон на килограмм (1Р=2,58*10 -⁴ Кл/кг).

Концентрация зависит от вида мутагена, объекта и экспозиции. Экспозиция — от 3 до 18 ч. После выдерживания семян в растворе его сливают и семена отмывают под струей водо­проводной воды. Готовить растворы химических мутагенов и обра­батывать ими объекты следует под вытяжкой и обязательно в рези­новых перчатках. При попадании раствора на кожу нужно немед­ленно смыть его. Семена можно высевать сразу после отмывки.

Таблица 12 – Концентрации химических мутагенов для обработки семян некоторых культур

В первом мутантном поколении — М₁ (в год обработки) можно обнаружить только доминантные мутации. Они встречаются реже рецессивных. Рецессивные мутации проявляются начиная с М₂. Нормы высева при выращивании Мг близки к принятым в про­изводстве. Обычно частота мутаций на главных побегах гораздо выше, чем на боковых. Поэтому нецелесообразно увеличивать в М₁ степень кущения. В этом поколении выявляют полезные доми­нантные мутации и отбирают их. У остальных растений берут соцве­тие главного побега, а из него определенное число семян, например, у пшеницы и ячменя — не менее 500 колосьев главных побегов, из колоса 20—30 семян. Потомство каждого колоса высевают от­дельно. В М₂ просматривают высеянные семьи и отбирают полез­ные мутации по внешнему виду растений. Это могут быть более раннеспелые формы, формы с прочным стеблем и т. д.

Морфологически ясно различимые мутации носят название макромутаций. Мутации, фенотипически не проявляющиеся или со слабым проявлением — микромутации, отбирать очень трудно. Подавляющее число отклонений по чисто количественным показателям при дальнейших испытаниях (в М₃ и последующих поколениях) ока­зывается модификациями.

Чтобы определить эффективность применения определенного мутагена, дозы, концентрации и т. д., рассчитывают процент ра­стений, образовавших семена в М_1,от числа высеянных всхожих се­мян (всхожесть определяют перед обработкой семян) В М₂ рассчитывают процент мутантных семей (число семей, в которых обнаружены мутантные растения, к общему числу семей), процент мутаций (к общему числу проанализированных растений в М₂) или число мутантов на 100 семей. Отобранные мутации используют в следующих поколениях.

Контрольные вопросы

1. По каким показателям проводят отбор мутантов

2. Виды мутагенеза, и используемые при этом мутагены