1.
Тетраплоидные сорта ржи, клевера, гречихи, турнепса и некоторых других культур, а также триплоидные гибриды сахарной свеклы широко используются в производстве. Ведется работа по созданию хозяйственно ценных полиплоидных форм других растений. Чаще всего для получения полиплоидов используют колхицин, так как он обеспечивает большой процент полиплоидных форм у всех сельскохозяйственных культур.
Раствором колхицина воздействуют либо на сухие, наклюнувшиеся и проросшие семена, либо на точки роста растений более позднего возраста.
Известно множество приемов обработки колхицином. Они различаются по концентрации раствора, экспозиции и технике воздействия.
У ржи тетраплоиды можно получать, воздействуя на сухие или наклюнувшиеся семена. Заранее приготовленный маточный раствор колхицина концентрации 1—2 % (его нужно хранить в темном месте) разводят до концентрации 0,01—1 %, заливают сухие семена поместив их в стеклянную емкость, и оставляют на срок от 3 ч до 3 сут (чем больше концентрация, тем меньше экспозиция). По истечении этого времени раствор сливают, а емкость с семенами подставляют под струю водопроводной воды для отмывки семян от раствора. Затем их высевают.
Можно воздействовать колхицином на наклюнувшиеся семена. Их завязывают в марлевый узелок и подвешивают под струю водопроводной воды на 3—4 ч, а затем оставляют в узелке на сутки при комнатной температуре, после чего обрабатывают колхицином, как описано выше.
Описанные способы просты, но они связаны с повреждением корневой системы, которая особенно чувствительна к колхицину. Этого можно избежать, если воздействовать на точки роста, изолировав корневую систему от попадания на нее раствора колхицина.
При работе с рожью применяют следующий способ. Наклюнувшиеся семена раскладывают на мелкоячеистую металлическую сетку. Сетку помещают в емкость, наполненную водой так, чтобы уровень ее смачивал нижнюю поверхность сетки. Сверху емкость закрывают стеклом для создания влажной камеры. Когда корешки достигнут длины 1—1,5 см и семена хорошо укрепятся на сетке, ее вынимают, переворачивают вверх корнями и опускают ростками в раствор колхицина. Корни должны быть вне раствора. Чтобы они не высыхали, нужно поместить их во влажную камеру. Хорошие результаты дает выдерживание в 0,2 %-ном растворе колхицина в течение 16—24 ч. Затем сетку с проростками переносят в кювету и возвращают в исходное положение. Кювету ставят под струю водопроводной воды на 2—3 ч для отмывки. В кювете проростки выдерживают сутки на воде или растворе Кнопа, после чего проростки с утолщенным (но не чрезмерно) гипокотилем, что является косвенным признаком полиплоидных форм, высаживают в ящики или вазоны, наполненные смесью почвы и песка. Через 2—3 нед ящики помещают в камеру для яровизации (при —1 °С) на 60 дней. Затем растения в тех же ящиках оставляют до созревания.
Сходный способ применяется для получения полиплоидов у клевера, только его семена сразу проращивают в чашках Петри на фильтровальной бумаге., которая, играет роль сетки. На 4—5-й день после начала проращивания фильтровальную бумагу вместе с проростками переносят в другую чашку Петри с раствором колхицина (0,2—0,25 %). В раствор опускают семядоли (экспозиция — 16 ч). После отмывки (достаточно трижды залить проростки водой и слить ее) проростки оставляют на фильтровальной бумаге в чашке Петри еще на 10 дней, после чего пересаживают в ящики с почвой. Пересаживают только проростки с разросшимися темно-зелеными семядолями. Через месяц, когда образуется розетка, растения с признаками тетраплоидов высаживают в поле.
При работе с другими объектами часто применяют капельный метод. Он состоит в том, что капли раствора колхицина периодически наносят на точки роста. Можно добавлять в раствор агар или камедь трагакантового астрагала (растение из семейства бобовые) — трагакант: в этом случае капли меньше растекаются. Трагакант после высыхания обладает свойством вторично набухать под действием влаги (росы, полива), что продлевает действие колхицина.
У сахарной: свеклы большой выход тетраплоидов дает обработка всходов в фазе «вилочки». Обработку ведут в теплице при температуре 15—20 °С и относительн9Й влажности воздуха 60—80 %. Семена высевают в ящики. На- 6—ГО-й день приступают в обработке. Глаз- ной пипеткой на проростки каждые 2—3 ч (в дневное время) наносят каплю раствора колхицина 0,2 %-ной концентрации. Обработку ведут в течение 12—20 дней. Семядоли под воздействием обработки утолщаются, первая и вторая пары листьев угнетаются, появление их задерживается. При сильном угнетении делают перерыв на Л—4 сут: обработку колхицином временно; прекращают. Примерно через месяц после окончания обработки растения, имеющие признаки тетраплоидов, высаживают в поле.
У свеклы второго года жизни оставляют 2—3 наиболее мощных цветоносных побега, остальные удаляют. Эту операцию проводят в самом начале вегетации. Когда оставленные побеги достигнут 6—8 см, начинают обработку. Готовят 0,3 %-ный раствор колхицина в 0,4 %-ном водном растворе агара. Раз в сутки наносят его на точки роста побегов. Растения выращивают, притеняя их (например, натянутой на каркасе марлей). Обработку прекращают, когда завершится рост побегов. Если побеги сильно угнетаются, делают перерыв. Удаляют вновь появляющиеся побеги.
Во всех случаях, во время обработки колхицином и пока растения еще не окрепли, их следует выдерживать при рассеянном свете. При работе с колхицином нужно соблюдать осторожность, работать в резиновых перчатках, не допуская попадания раствора на кожу.
В год обработки колхицином возникают, как правило, химерные по плоидности растения, а значит, различные по плоидности семена. Задача состоит в том, чтобы выбрать растения, имеющие наибольшее количество тетраплоидных клеток. Для этого используют косвенные признаки. Контроль по косвенным признакам в необходимых случаях дополняют цитологическим контролем.
Контроль за плоидностью должен быть многократным, так как в химерных по плоидности тканях- диплоидные участки могут вытеснять тетраплоидные. Тетраплоидные растения обычно имеют более короткие междоузлия, более широкие и толстые листовые пластинки темно-зеленого цвета, более крупные цветки и плоды, у них часто проявляется махровость цветка. Хорошими диагностическими признаками служат длина и ширина замыкающих клеток устьиц, число хлоропластов в них, размер пыльцевых зерен и количество пор в них. У тетраплоидов все эти показатели выше, чем у диплоидов. Выбор наиболее эффективного диагностического признака зависит от объекта.
У ржи в год обработки колхицином, помимо утолщенного гипокотиля, признаками полиплоидности служат широкий темно-зеленый лист с крупной широкой лигулой, крупная двухпоровая пыльца (у гаплоидных пыльцевых зерен — одна пора), более крупные семена.
У клевера растения с преобладанием тетраплоидных тканей имеют крупные толстые темно-зеленые семядоли, утолщенные черешки листьев. Листья темно-зеленые, часто гофрированные. Опушение более редкое, но длинное и поэтому очень заметное. Пыльцевые зерна округло-угловатые в отличие от овальных у диплоидов.
При обработке колхицином сахарной свеклы в фазе «вилочки» первый отбор по особенностям листьев ведут при высадке растений в поле, второй, также по морфологическим признакам,— после приживания растений, третий — цитологическими методами (препараты готовят из листьев). На следующий год у высадков цветоносные побеги контролируют по числу хлоропластов (оно достигает у тетраплоидов 24—25 против 13—15 у диплоидов). Диплоидные побеги удаляют. Затем ведут цитологический контроль. Оставляют растения (побеги), имеющие не менее 70—80 % тетраплоидных клеток.
При обработке колхицином сахарной свеклы 2-го года жизни тетраплоидные побеги выявляют, просматривая пыльцу и определяя число пор в экзине (у тетраплоидов оно в 2,5 раза больше). Оставляют те побеги, где диплоидная пыльца составляет не менее 90— 95 %.
Окончательно выделяют тетраплоиды в С1 (растения, выросшие из семян, полученных на обработанных растениях). У ржи и сахарной свеклы применяют цитологический контроль. У ржи для этой цели можно использовать корешки проростков, у сахарной свеклы — молодые листья. У клевера форма пыльцевых зерен — настолько надежный диагностический признак, что к цитологическому контролю можно не прибегать.
Контрольные вопросы
1. По каким показателям идентифицируется полиплоиды
2. Какой способ применяют при работе с рожью
3. Выбор наиболее эффективного диагностического признака зависит от
2. Получение и отбор мутантных форм растений
Экспериментальный мутагенез как метод получения ценных форм сельскохозяйственных растений прочно вошел в селекционную практику. Используют как физические, так и химические мутагены. В качестве физических мутагенов чаще всего применяют ионизирующее излучение: гамма, рентгеновское и быстрые нейтроны. Сами селекционеры облучением не занимаются. Его проводят специалисты-физики. Удобнее всего облучать сухие семена. Для различных культур рекомендуют разные дозы облучения. Они должны быть на 15—20 % ниже критических.
Дозы быстрых нейтронов в 10—20 раз меньше (выражают их в единицах поглощенной энергии — греях). После воздействия рентгеновским и гамма-излучением или быстрыми нейтронами семена можно сразу высевать.
В качестве химических мутагенов используют этиленимин, этилметансульфонат, гидроксиламин, нитрозоэтилмочевину, нитрозометилмочевину, диэтилсульфат, 1,4-бисдиазоацетилбутан и некоторые другие. Их применяют в малых концентрациях — от 0,0001 до 3 %.
Таблица 11- Критические дозы для облучения рентгеновским и гамма-излучением сухих семян некоторых сельскохозяйственных культур
Культура |
Критичес кая доза, кР * |
Культура |
Критическая доза, кР * |
|
Пшеница мягкая Ячмень Рожь Овес Кукуруза |
15—20 20—23 10—15 25 10-15 |
Горох посевной Лен Люпин Клевер луговой |
5-15 80-150 5-8 30 |
|
* В единицах СИ —кулон на килограмм (1Р=2,58*10 -4 Кл/кг).
Концентрация зависит от вида мутагена, объекта и экспозиции. Экспозиция — от 3 до 18 ч. После выдерживания семян в растворе его сливают и семена отмывают под струей водопроводной воды. Готовить растворы химических мутагенов и обрабатывать ими объекты следует под вытяжкой и обязательно в резиновых перчатках. При попадании раствора на кожу нужно немедленно смыть его. Семена можно высевать сразу после отмывки.
Таблица 12 – Концентрации химических мутагенов для обработки семян некоторых культур
Культура |
Мутаген |
||
Этиленимин |
этилметан-сульфонат |
Нитрозо-метил-мочевина |
|
Пшеница Ячмень Горох |
0,01—0,06 0,03—0,06 0,02—0,06 |
0,5-1,5 0,5-1 0,15-0,5 |
0,0001 0,0001 |
В первом мутантном поколении — М1 (в год обработки) можно обнаружить только доминантные мутации. Они встречаются реже рецессивных. Рецессивные мутации проявляются начиная с М2. Нормы высева при выращивании Мг близки к принятым в производстве. Обычно частота мутаций на главных побегах гораздо выше, чем на боковых. Поэтому нецелесообразно увеличивать в М1 степень кущения. В этом поколении выявляют полезные доминантные мутации и отбирают их. У остальных растений берут соцветие главного побега, а из него определенное число семян, например, у пшеницы и ячменя — не менее 500 колосьев главных побегов, из колоса 20—30 семян. Потомство каждого колоса высевают отдельно. В М2 просматривают высеянные семьи и отбирают полезные мутации по внешнему виду растений. Это могут быть более раннеспелые формы, формы с прочным стеблем и т. д.
Морфологически ясно различимые мутации носят название макромутаций. Мутации, фенотипически не проявляющиеся или со слабым проявлением — микромутации, отбирать очень трудно. Подавляющее число отклонений по чисто количественным показателям при дальнейших испытаниях (в М3 и последующих поколениях) оказывается модификациями.
Чтобы определить эффективность применения определенного мутагена, дозы, концентрации и т. д., рассчитывают процент растений, образовавших семена в М1,от числа высеянных всхожих семян (всхожесть определяют перед обработкой семян) В М2 рассчитывают процент мутантных семей (число семей, в которых обнаружены мутантные растения, к общему числу семей), процент мутаций (к общему числу проанализированных растений в М2) или число мутантов на 100 семей. Отобранные мутации используют в следующих поколениях.
Контрольные вопросы
1. По каким показателям проводят отбор мутантов
2. Виды мутагенеза, и используемые при этом мутагены