П.А. Иконников А.А. Белозёрова ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ.

---

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА БОТАНИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ

П.А. Иконников

А.А. Белозёрова

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

Учебно-методический комплекс

Практикум для студентов

специальностей 020201.65 «Биология», 020803.65 «Биоэкология» и направления 020200.62 «Биология» (бакалавр)

Издательство

Тюменского государственного университета

2010

УДК: 581.1(075.3)

ББК: 28.75 я73

Ф 504, И 422

П.А. Иконников, А.А. Белозёрова. Физиология растений: Учебно-методический комплекс. Практикум для студентов специальностей 020201.65 «Биология», 020803.65 «Биоэкология» и направления 020200.62 «Биология» (бакалавр). Часть II. Тюмень: Издательство Тюменского государственного университета, 2010, 41 с.

Практикум предназначен для выполнения лабораторных работ по курсу физиологии растений. Содержит описание экспериментальных работ, разъяснения основных необходимых понятий и терминов.

Рабочая учебная программа дисциплины опубликована на сайте ТюмГУ: Физиология растений [электронный ресурс]/ Режим доступа: http://www.umk.utmn.ru., свободный.

Рекомендовано к изданию кафедрой ботаники и биотехнологии растений. Утверждено проректором по учебной работе Тюменского государственного университета.

ОТВЕТСТВЕННЫЙ РЕДАКТОР: Н.А. Боме, зав. кафедрой ботаники и

биотехнологии растений, д.с.-х.н.,

профессор

РЕЦЕНЗЕНТЫ:

Н.Н. Колоколова, к.б.н., доцент

кафедры ботаники и

биотехнологии растений

биологического факультета ТюмГУ

Л.С. Тупицына, к.б.н., доцент

кафедры экологии и генетики

биологического факультета ТюмГУ

© ГОУ ВПО Тюменский государственный университет, 2010.

ТЕМА ЧЕТВЕРТАЯ

ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ

Понятие "дыхание" включает в себя сложный комплекс биологических окислительно-восстановительных процессов, в ходе которых образуется много промежуточных продуктов, необходимых для специфических синтезов органических веществ, характеризующих данный вид растений, освобождается энергия, запасаемая в форме АТФ и градиента электрохимического потенциала.

Внешним наиболее общим проявлением дыхания является поглощение кислорода и выделение СО₂. Итоговое уравнение:

С₆Н₁₂О₆ + 6О₂ → 6СО₂ +6Н₂О+ 686 ккал

Работа 1. Определение интенсивности дыхания прорастающих семян

ХОД РАБОТЫ

В данном случае интенсивность дыхания определяют по количеству СО₂, выделенного 100 г сырой навески растительного материала за 1 час. Берут стеклянную банку на 300 мл, закрытую корковой пробкой, с крючком внутри для подвешивания марлевого мешочка с прорастающими семенами. Наливают из герметично закрытого сосуда 25 мл раствора барита – Ва(ОН)₂ в концентрации 7 граммов чистого гидрата окиси на 1 л дистиллированной воды, предварительно несколько суток настоянного. В мешочек из марли отвешивают 10 г проросших семян или зеленых органов растений и закрепляют на крючке над раствором барита.

После этого оставляют баночку при комнатной температуре на 20-30 минут. В течение этого времени надо осторожно взбалтывать барит, не обжигая семена, для разрушения образующейся при этом пленки ВаСО₃, препятствующей полноте поглощения СО₂. По окончании опыта быстро вынимают мешочек с семенами и титруют этот раствор щавелевой кислотой в присутствии 2^х-3^х капель фенолфталеина до появления исчезающего слаборозового окрашивания (титр Н₂С₂О₄ – 2,8636 г на 1 л дистиллята. 1 мл этого раствора, пошедшего на титрование, как раз соответствует 1 мг СО₂).

Для определения интенсивности дыхания при других условиях параллельно ставят баночки в сосуды с термостатированной водой (Т=+30°С и +4°С – вода со льдом). Одновременно закладывают контрольный опыт с баритом, но без семян. Если анализируются объекты, содержащие хлорофилл, то их на все время опыта помещают в темноту, для исключения фотосинтеза.

Результаты опыта занести в таблицу:

Объект	Варианты опыта	Навеска	Прилито Ва(ОН)2	Количество Н2С2О4 при титровании	Разность при титровании контроля и опыта, мг СО2	Интенсив­ность дыхания, мг СО2 на 100 г сырого веса в час

Разность количества мл щавелевой кислоты, пошедшей на титрование контрольной и опытной колб, дает величину СО₂ в мг, которую выражают на 100 г навески в час.

Вычисления ведут по формуле:

где А – количество мл кислоты в контрольном опыте;

В – количество мл Н₂С₂О₄, пошедшей на титрование в опытной банке;

Д – взятая навеска.

Зарисовать установку. Сделать вывод, сопоставив интенсивность дыхания различных объектов в различных условиях.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) баночки на 300 мл; 2) раствор Ва(ОН)₂; 3) щавелевая кислота; 4) фенолфталеин; 5) бюретки для титрования; 6) герметичная установка для барита; 7) проросшие семена или зеленые части растений; 8) весы.

Работа 2. Определение дыхательного коэффициента

Дыхательным коэффициентом (ДК) называют отношение количества выделенного при дыхании СО₂ к поглощенному кислороду (СО₂/О₂). Величина ДК может зависеть от характера окислительного обмена изучаемого объекта, содержания кислорода в среде. В значительной степени величина ДК зависит от химической природы окисляемого при дыхании вещества (субстрата). Если окисляются углеводы, то дыхательный коэффициент близок к 1. Для полного окисления дыхательного субстрата с меньшей степенью окисленности углерода (как, например, белки и жиры) потребуется больше кислорода и ДК будет всегда меньше 1, и наоборот, при окислении субстрата с большей степенью окисленности (например, органические кислоты) ДК будет больше 1.

Рассчитайте и сравните ДК при окислении органических кислот, например пировиноградной, щавелевой, аминокислот, жирных кислот.

ДК может быть определен любым методом, позволяющим учесть и О₂ и СО₂. ДК прорастающих семян можно определить очень простым методом Рихтера с помощью прибора, состоящего из пробирки с каучуковой пробкой, в которую вставлена изогнутая под прямым углом капиллярная трубка. К задней стороне трубки прикрепляется полоска миллиметровой бумаги. Пробирка во время опыта должна находиться в термостатических условиях. Для этого ее ставят в ванну с постоянной температурой, при отсутствии ванны ставят в банку с ватой.

ХОД РАБОТЫ

2/3 объема пробирки заполняют проросшими семенами и плотно закрывают ее пробкой с измерительной трубкой. Необходимо как можно меньше нагревать пробирку рукой. После того как пробирку закрыли, ее ставят в условия с постоянной температурой.

После 10-минутного термостатирования в наружный конец измерительной трубки кисточкой вносят большую каплю (так, чтобы она заняла в капилляре 1-1,5 см) вазелинового или другого масла. Изменение положения капли в измерительной трубке указывает на изменение объема воздуха в приборе. Направление изменений объема воздуха в пробирке зависит от величины ДК исследуемого объекта. Если ДК меньше 1, объем воздуха в пробирке будет уменьшаться, и капля масла будет смещаться в сторону пробирки; при увеличении объема воздуха (если ДК больше 1) движение капли обратное.

После капли от конца капилляра отмечают положение внутреннего мениска капли и засекают время. Через 1-2 минуты вновь отмечают на миллиметровой бумаге положение капли. Так отмечают положение капли через равный промежуток времени 3-5 раз и рассчитывают среднюю скорость движения капли. В случае, когда капля смещается в сторону пробирки, скорость движения капли (А) соответствует разности между объемами поглощаемого кислорода и выделяемого СО₂:

(1)

После этого пробирку открывают. Из измерительной трубки удаляют масло, для чего к концу трубки, ближнему к пробке, подводят воздух, а к противоположному концу прикладывают кусочек фильтровальной бумаги, который впитывает масло.

Полоску фильтровальной бумаги свертывают в кольцо по диаметру пробирки, держа его пинцетом, смачивают концентрированным раствором КОН и укрепляют его над семенами. Кольцо хорошо держится на стекле. Необходимо следить, чтобы щелочь не попадала на семена, а также, чтобы кольцо не мешало закрыть пробирку пробкой. Снова вводят в капилляр каплю вазелинового масла и определяют скорость (расстояние) движения капли. Теперь выделяемый семенами СО₂ поглощается щелочью и скорость движения капли (В) соответствует объему поглощаемого при дыхании кислорода:

Согласно уравнению (1), объем выделенного за единицу времени СО₂ соответствует СО₂ = В – А, следовательно ДК может быть рассчитан по уравнению:

Сравнивают ДК семян, у которых в качестве дыхательного субстрата могут быть использованы различные вещества. Заполняют таблицу:

Объект	Скорость движения капли	В – А	ДК
А (без щелочи)	В (со щелочью)
	отсчеты	среднее	отсчеты	среднее

Теоретически рассчитать ДК при окислении СО₂ и Н₂О какого-либо жира, например, триолеина с формулой С₅₇Н₁₀₄О₆. Сделать вывод о зависимости ДК от природы окисляемых веществ. Нарисовать прибор.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) пробирка с герметичной газоотводной трубкой; 2) пипетка; 3) линейка из миллиметровой бумаги; 4) прорастающие семена подсолнечника.

Изучение ферментных систем дыхания

Работа 3. Окислительные ферменты дыхания

Из многих окислительно-восстановительных ферментов, вырабатываемых растениями, в данной работе исследуются только два:

1. Полифенолоксидаза – фермент, повышающий окислительный потенциал молекулярного кислорода, соединяя его с водородом, отщепляемым от полифенолов по схеме:

дифенол хинон

2. Пероксидаза – фермент, активизирующий кислород воздуха, окисляющий полифенолы и ароматические амины кислородом в присутствии перекиси водорода, например:

дифенол + Н₂О₂ → хинон + 2Н₂О

Обнаружить эти ферменты можно при помощи раствора гваяколовой смолы, которая при окислении активированным (атомарным) кислородом меняет свою окраску из коричневой в синюю. Работу удобно проводить на двух срезах исследуемой части растений, нанося на первый срез раствор гваяколовой смолы, а на второй – раствор гваяколовой смолы и перекись водорода. Посинение первого среза свидетельствует о присутствии в клетках полифенолоксидазы, тогда как посинение второго среза есть результат совместного действия двух ферментов: полифенолоксидазы и пероксидазы или в случае отсутствия в данном объекте первого фермента – одной пероксидазы.

ХОД РАБОТЫ

Поместить на тарелку 2 куска исследуемого объекта и облить оба куска одновременно раствором гваяколовой смолы, причем второй срез дополнительно обработать каплей раствора перекиси водорода. Для контроля обработать таким же образом материал, предварительно подвергнутый кипячению. Исследовать несколько объектов, не допуская при этом попадания сока из одного объекта на срез другого.

Результаты занести в таблицу:

Объект	Посинение при действии
гваяколовая смола	гваяколовая смола +NaCl	гваяколовая смола +H2О2	гваяколовая смола + H2О2+NaCl
Картофель сырой
Картофель вареный
Редька
Луковица

Можно ингибировать полифенолоксидазу хлоридами, посыпав поверх среза клубня NaCl или BaCl, KCl, CaCl и т.д. Пероксидаза хлоридами ингибируется в меньшей степени, поэтому при добавлении перекиси водорода на срез, где была нанесена соль и добавлена гваяколовая смола, посинение все же происходит, хотя и менее интенсивно.

В целом данная работа подтверждает теорию А.Н. Баха об активации ферментами-оксидазами О₂ воздуха в заключительной стадии дыхания.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) клубни картофеля, корнеплоды редьки, корни хрена и др.; 2) 1%-ный спиртовой раствор гваяколовой смолы; 3) 3%-ный раствор перекиси водорода; 4) тарелки; 5) скальпель.

Работа 4. Обнаружение редуцирующих ферментов при дыхании семян

ХОД РАБОТЫ

10 пророщенных семян гороха очищают от кожуры и разделяют на семядоли. Половину всех семян помещают в колбочку с водой и кипятят в течение 3 минут, считая после закипания, чтобы убить ферменты. Затем обе порции семядолей помещают в две пробирки с раствором метиленовой синьки и оставляют на несколько минут до посинения поверхности семядолей.

Семядоли отмывают водопроводной водой и заливают дистиллированной водой в пробирке так, чтобы слой воды был выше семян на 2 см, помещают на водяную баню с температурой 30-35°С.

Через несколько минут наблюдают полное исчезновение синей окраски у семядолей, не подвергавшихся кипячению вследствие превращения метиленовой синьки в бесцветное лейкосоединение.

В данном опыте метиленовая синька выступает в роли акцептора водорода.

структурная формула восстановленная

метиленовой сини метиленовая синь

(окрашенная, базоформа) (бесцветная, лейкоформа)

Подобный эксперимент можно проводить с зелеными частями высших растений, например, с элодеей, пеларгонией, колеусом и др.

Здесь четко прослеживается взаимосвязь восстановительной активности с возрастом растения.

В практической агрономии этот метод используется для определения жизнеспособности семян и отдельных органов растений, где об этом свидетельствует степень окрашенности (интенсивность) семян метиленовой синью (метод Нелюбова).

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) спиртовка; 2) пробирки; 3) баня; 4) колбочки на 50 мл; 5) раствор метиленовой синьки; 6) семена гороха или фасоли.

Работа 5. Обнаружение дегидрогеназ при спиртовом брожении

В нормальных условиях спиртового брожения образовавшийся в процессе декарбоксилирования пировиноградной кислоты уксусный альдегид

пируватдекарбоксилаза

СН₃-СО-СООН СН₃СОН + СО₂

восстанавливается с помощью фермента алкогольдегидрогеназы и ее кофермента НАД·Н₂ в спирт этанол:

алкогольдегидрогеназа

СН₃СОН + НАД·Н₂ СН₃СН₂ОН + НАД

Если ввести второй акцептор водорода, например, метиленовую синь, то последняя, присоединяя водород, будет переходить в лейкосоединение и раствор обесцветится.

ХОД РАБОТЫ

Убедиться в наличии дегидрогеназ при спиртовом брожении можно следующим образом. В колбу емкостью 100 мл внести 2 г прессованных дрожжей, прилить 20-30 мл 3%-ного сахара и хорошо взболтать. Затем прилить еще 40-50 мл раствора и снова взболтать. Взять 2 пробирки. Одну из них заполнить почти доверху раствором с дрожжами. Оставшийся раствор в колбе перекипятить в течение 3 минут, остудить и налить во вторую пробирку (контрольную). В обе пробирки внести 3-5 капель раствора метиленовой сини и закрыть ватными пробками. Поместить в водяную баню с температурой около 35°С.

Восстановление метиленовой сини в опытной пробирке начинается через несколько минут и вскоре раствор полностью обесцвечивается (20-25 минут). Раствор в контроле остается без изменения. Если, вынув ватную пробку из опытной пробирки, хорошо взболтать раствор либо продуть воздухом, то синяя окраска снова возвращается вследствие окисления кислородом воздуха образовавшегося лейкосоединения.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) колбы на 50 мл; 2) 3%-ный раствор сахара; 3) прессованные или сухие дрожжи; 4) водяная баня; 5) пробирки; 6) спиртовка; 7) метиленовая синь; 8) ватные пробки.

Работа 6. Метод определения активности дегидрогеназ с помощью вакуум-инфильтрации (по Пыльневу)

В основу метода положена способность дегидрогеназ восстанавливать бесцветные соли тетразолия с образованием окрашенного формазана. Бесцветный ТТХ – 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид, присоединяя водород, восстанавливается до формазана красного цвета. Формазан нерастворим в воде, но хорошо растворяется в ацетоне или изопропиловом спирте. Метод позволяет работать с малыми навесками материала и выявлять активность дегидрогеназ как бесцветных (что удобнее), так и окрашенных пигментами биологических тканях.

ХОД РАБОТЫ

При работе нужно выбирать однородный материал и разрезать крупные объекты на пластинки толщиной 1,5-2 мм. В маленькие бюксы берут навески по 30-100 мг предварительно разрезанного на пластинки растительного материала. Для навески заливают 5 мл раствора 2,3,5-трифенилтетразолия, приготовленного на буферной смеси; третью (контрольную) погружают в 5 мл чистой буферной смеси. Исследуемый материал сверху придавливают небольшим грузом (стеклянной пробкой) и помещают в вакуум-эксикатор, из которого масляным насосом выкачивают воздух, под давлением которого раствор начинает проникать в ткани. Бюксы закрывают крышками и переносят на 30 минут в термостат с температурой 31°С, где ткани приобретают красный цвет, интенсивность которого зависит от активности дегидрогеназ.

Затем каждую пробу вынимают из бюкса и тщательно растирают в ступке с небольшим количеством ацетона или изопропилового спирта. Содержимое ступки переносят в мерный цилиндр и доводят до 5-10 мл, в зависимости от интенсивности окраски. Остатки измельченной ткани должны полностью обесцветиться. После растирания все пробы центрифугируют в течение 3 минут при 1 500 оборотов в минуту и полученный окрашенный формазаном экстракт сразу колориметрируют на ФЭК при синем светофильтре. Если контрольная вытяжка зеленая, то чтобы снять цвет хлорофилла, колориметрируют при зеленом светофильтре. Активность дегидрогеназ вычисляют по разнице оптической плотности между показаниями ФЭК в опытных и контрольных пробах. Эта разница, выраженная в целых числах, названа индексом активности дегидрогеназ.

Результаты опыта записывают по следующей схеме:

Объект	Навеска ткани, мг	Оптическая плотность	Индекс активности дегидрогеназ
контроль	опыт

Все три выполняемые в практикуме работы (4, 5, 6) служат ярким подтверждением теории В.И. Палладина об активации водорода (отщеплении от дыхательного субстрата) в анаэробной стадии дыхания.

МАТЕРИАЛ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) проростки злаковых, клубни картофеля или другой растительный материал; 2) 1/15 М буферная смесь Серенсена III с рН 7,17; 3) 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый, 0,25-0,5%-ный раствор, приготовленный на буферной смеси Серенсена III; 4) 85%-ный ацетон или изопропиловый спирт; 5) бюксы; 6) мерные цилиндры на 10 мл; 7) лезвия безопасной бритвы; 8) фарфоровые ступки; 9) весы торзионные или аналитические; 10) вакуум-эксикаторы; 11) насос Камовского; 12) термостат; 13) центрифуга; 14) ФЭК.

ПРИМЕЧАНИЕ. Для приготовления 1/15 М буферной смеси Серенсена с рН 7,17 в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,831г Na₂НРО₄× 2Н₂О и 0,272 г КН₂РО₄.

Работа 7. Определение активности каталазы в растительных объектах

Каталаза – очень распространенный дыхательный фермент, присутствующий практически в любом биологическом материале растений и животных.

В процессе дыхания в качестве побочного продукта окисления веществ образуется перекись водорода, оказывающая в высоких концентрациях токсичное действие на цитоплазму. Обезвреживание перекиси происходит при участии фермента каталазы (одна из его функций), разлагающей ее на воду и молекулярный кислород по уравнению:

каталаза

2 Н₂О₂ 2Н₂О +О₂

Об активности каталазы судят по объему кислорода, выделяющегося в результате разложения перекиси водорода.

Для определения пользуются прибором, который состоит из каталазника, бюретки емкостью 50 мл и стеклянной груши, соединенных каучуковыми трубками и стеклянным тройником, каучуковая трубка на конце тройника снабжена винтовым замком. Бюретка и стеклянная груша закреплены на штативе. Их заполняют дистиллированной водой до половины объема.

ХОД РАБОТЫ

0,5 г листьев растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком и добавляют 0,5 г мела для создания щелочной реакции (рН=7,7 оптимальная для данного фермента).

Во время растирания вливают небольшими порциями 20 мл воды, смесь вносят в одно колено каталазника. В другое колено помещают 5 мл 3%-ной перекиси водорода. Каталазник соединяют с каучуковой трубкой, не допуская смешивания жидкостей.

Открывают зажим и перемещением воронки устанавливают уровень воды в бюретке на нуле. Закрывают зажим и быстрым изменением положения каталазника смешивают жидкость в обоих коленах. Затем все время потряхивая каталазник по снижению уровня воды в бюретке отмечают объем кислорода в мл, выделенного в течении 3 минут на 1 г массы сырого материала.

Во время опыта каталазник нельзя держать всей ладонью, так как при нагревании от руки воздух в колбе расширяется, что может повлиять на точность отсчета. При отсчете вода в круглой воронке и бюретке должна быть на одном уровне.

Определяют активность каталазы в листьях верхнего и нижнего ярусов. Можно использовать также проростки различных сортов сельскохозяйственных культур, различающихся по скороспелости к неблагоприятным воздействиям.

Результаты опыта заносят в таблицу:

Ярусы листьев на растении	Навеска листьев, г	Выделилось О2 за 3 минуты	Активность каталазы, мл О2 на 1 г сырого материала
Верхний	0,5
Нижний	0,5

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) растение с несколькими ярусами листьев, проростки пшеницы или другой культуры; 2) промытый речной песок; 3) порошок мела; 4) 3%-ный раствор перекиси водорода; 5) фарфоровые ступки с пестиком; 6) мерные цилиндры на 25 мл; 7) прибор для определения каталазы; 8) часы; 9) весы с разновесами.

ТЕМА ПЯТАЯ

МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ РАСТЕНИЙ

Минеральные элементы являются составной частью обмена веществ в растении. Роль их многообразна и сводится к включению в состав органических соединений, образующих тело растения, они активируют процессы, входя в состав ферментов, физиологически важных соединений или даже будучи эффекторами отдельных ферментативных реакций. Минеральные элементы обеспечивают осмотические процессы клеток, определенное значение рН клетки, электрический заряд мембран, регулируют поступление других элементов и пр. В конечном счете, поэтому минеральному питанию принадлежит решающее место в формировании урожая.

Анализ элементарного состава сухой массы растений показывает, что в среднем они содержат С – 45%, О – 42%, Н – 6,5%, N – 1,5%. Эти четыре элемента, так называемые органогены, в составе золы не присутствуют. Оставшиеся 5% сухой массы приходятся на зольные элементы, среди которых кроме названных по последней информации важную роль играют макроэлементы (содержание их в золе от процентов до сотых долей) – P, S, K, Ca, Mg, Fe, и микроэлементы, содержащиеся в золе от тысячных долей процента до миллионных, к ним относят Mn, Cu, Zn, B, Mo. Кроме того, некоторые авторы выделяют и ультрамикроэлементы, содержание которых ниже миллионных долей процента. Их роль до сих пор не выяснена. Элементы относят к необходимым, если без них растение не может закончить нормальный жизненный цикл.

Дополнительно была выделена группа «полезных» элементов Na, Cl, Si, Co, которые могут быть необходимы лишь отдельным видам растений (например, Na и Cl – галофитам, Si – хвощам, Co – бобовым и т.д.).

Особенность минерального обмена растений – накопление элементов в тканях в гораздо более высокой концентрации, чем во внешней среде. Другая особенность – специфичность потребности в элементах, в том числе иногда токсичных для человека (тяжелых металлов, нитратов и др.). В то же время важным является использование растений в фиторемедиации (т.е. в очистке окружающей среды) – разделе науки, которая в настоящее время интенсивно развивается.

Благодаря минеральным элементам синтезируются такие классы соединений как белки, углеводы, жиры, нуклеиновые кислоты, высокоэнергетические биомолекулы и другие вещества, образующие конституцию тела растений, работают электрон-транспортные цепи фотосинтеза и дыхания и т.д.

В настоящее время наукой о минеральном питании изучаются механизмы поступления ионов в интактное (целостное) растение, их распределение в органах, исследуется роль и функция элементов, выясняются системы регуляции минерального питания и взаимодействия органов. Доказывается роль корневой системы не только как органа закрепления на субстрате, поглощения элементов, но и как органа синтезирующего ряд специфических веществ (например, алкалоиды и фитогормоны), выделительная функция ее при взаимодействии с другими организмами (фитоалексины) и преобразующими окружающий субстрат (кислые фосфатазы, органические кислоты, фитосидерофоры).

Работа 8. Подача с пасокой аминокислот и амидов, синтезированных корневой системой из поглощенных неорганических соединений азота

Очень важно и то, что корневая система не только орган поглощения воды и минеральных веществ, но и орган первичного синтеза многих органических соединений. При поглощении из наружной среды минеральных соединений азота (ионов NH⁴⁺ и NO^3-) часть их подается в надземные органы в неизменном виде, но, как впервые доказано Д.А. Сабининым, большая часть минеральных соединений азота уже в тканях корня превращается в органические соединения: аминокислоты, амиды, белки. Аминокислоты и амиды подаются в надземные органы, что можно обнаружить, анализируя пасоку растений.

Для работы используют метод определения в растворах суммарной концентрации всех аминокислот и амидов (метод Н.А. Бояркина). Метод основан на сравнении интенсивности окрашивания пятен, полученных на фильтровальной бумаге после реакции с нингидрином стандартных растворов аминокислот и испытуемой пасоки содержащей то или иное количество азотистых соединений. Нингидрин реагирует с большинством α-кислот, дезаминируя и декарбоксилируя их. В результате реакции образуются окрашенные продукты, цвет которых колеблется от сине-фиолетового до розово-фиолетового. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации аминокислот.

В качестве стандартных используют два раствора: аланин и глютаминовую кислоту. Аланин дает с нингидрином сине-фиолетовое окрашивание, а глютаминовая кислота – розово-фиолетовое.

ХОД РАБОТЫ

1. У 10-15-дневных проростков кукурузы, тыквы или других растений, выращенных на питательной смеси Кнопа, срезают надземные органы. Через короткий промежуток времени на поверхности стебля из порезанных сосудов ксилемы появляются капли пасоки. Алюминиевой петлей их переносят на полоски хроматографической бумаги. Можно на пенек плотно надеть стеклянный капилляр, в него поднимется пасока.

2. Приготавливают: а) 0,5%-ный раствор нингидрина в 96%-ном этаноле; б) серию растворов аланина и глютаминовой кислоты с равным содержанием аминогрупп.

Концентрации растворов следующие:

глютаминовая кислота: 10 5 2,5 1,25 мг/мл

аланин: 6,4 3,2 1,6 0,8 мг/мл

3. Из хроматографической бумаги нарезают полоски размером 8×1,5 см. На трех полосках бумаги ставят обычным карандашом 4 точки на расстоянии 1 см друг от друга. Алюминиевой петлей (d=2 мм) наносят на одну полоску растворы глютаминовой кислоты, на вторую – аланина (разных концентраций), на третью – четыре капли паcоки (паcоку предварительно из капилляра переносят в часовое стекло). Высушивают полоски на воздухе, после чего при помощи ватной кисточки быстрым движением пропитывают их раствором нингидрина. Снова высушивают их на воздухе. Кладут полоски бумаги между двумя стеклами, нагретыми до 40-60°С, и оставляют при этой температуре 3-10 минут. Все операции для полосок с пасокой и для полосок со стандартными растворами должны быть строго одинаковыми.

Сравнение интенсивности окрашивания пятен пасоки с интенсивностью окрашивания пятен стандартных растворов позволяет сделать заключение о суммарной концентрации аминокислот и амидов в пасоке. Пятна сравнивают с пятнами раствора аланина и глютаминовой кислоты в зависимости от оттенка окраски пятен пасоки. Концентрацию аминокислот в пасоке выражают в мг/мл и в мг азота аминогрупп/мл.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) 10-15-дневные проростки кукурузы или других растений; 2) питательная смесь Кнопа; 3) хроматографическая бумага; 4) алюминиевая петля; 5) часовые стекла; 6) 0,5%-ный раствор нингидрина на 96%-ном этаноле; 7) аланин; 8) глютаминовая кислота; 9) стеклянные капилляры.

Работа 9. Поступление минеральных веществ в растения

ХОД РАБОТЫ

1. Поступление в корни сернокислой меди.

Часть одно- и двухнедельных проростков гороха, фасоли помещают в 1%-ный раствор CuSO₄ (за сутки до опыта). Другую часть проростков составляют в дистиллированной воде для контроля.

Извлечь опытное растение из раствора, отмыть корни водой и поместить в 5%-ный раствор желтой кровяной соли на 2-3 минуты. Произойдет яркое красновато-розовое окрашивание (в результате взаимодействия реактива с солью). То же самое проделать с контрольным растением.

При рассмотрении результатов опыта оба растения поместить корнями в чистую воду. Затем сделать поперечный срез, перенести его в воду для восстановления тургора. Срезы брать не очень тонкие – 1/2-1/3 мм. Рассматривая срез, убедиться по окраске в характере распределения поглощенного вещества (в отличие от простого физического поглощения пористым телом).

2. Поступление в корни железа.

В стакан емкостью 100 мл наливают 20 мл 0,15%-ного раствора сернокислого (закисного) железа, помещают в него 40 штук проростков, корнями в раствор. Через 10-15 минут из исходного раствора и из стакана с проростками берут по 2 мл, переносят в 2 пробирки и в каждую добавляют по 3 капли 0,3%-ного раствора желтой кровяной соли.

Сравнить интенсивность окрашивания.

3. Поступление в корни солей аммония.

Готовят 0,003%-ный раствор сернокислого аммония. Реактивом служит реактив Несслера. С ионами аммония он дает желто-коричневое окрашивание. Опыт с проростками проводят также как и предыдущий.

4. Значение для поступления минеральных веществ аэрации корневой системы.

Используются растворы солей железа и аммония той же концентрации. В три стакана наливают по 20 мл того и другого раствора. В два стакана помещают проростки. В одном из стаканов с проростками при помощи резиновой груши или другого аэратора через раствор непрерывно продувают струю воздуха.

Через 10 минут констатируют более активное потребление ионов солей корнями в стакане, который подвергался аэрации. Контролем служит раствор без проростков. Сравнение степени окраски в пробирках проводят также как и в предыдущих опытах.

5. Поступление в корни нитратов.

За день до проведения опыта в пробирку наливают 8 мл 0,025%-ного раствора KNO₃ и сюда же помещают 5-8 проростков. Опыт проводят так: стеклянной палочкой берут каплю раствора, в котором находились корни, и наносят ее в виде мазка на фарфоровую пластинку и добавляют каплю 1%-ного раствора дифениламина в крепкой серной кислоте. То же проделывают с контрольным раствором. Наблюдают за окраской.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) проростки гороха или других растений; 2) 1%-ный раствор CuSO₄; 3) 5%-ный раствор желтой кровяной соли; 4) все для микроскопирования; 5) стаканы, пробирки; 6) 0,15%-ный раствор сернокислого железа; 7) 0,3%-ный раствор желтой кровяной соли; 8) 0,003%-ный раствор сернокислого аммония; 9) реактив Несслера; 10) 0,025%-ный раствор KNO₃; 11) 1-%-ный раствор дифениламина в крепкой серной кислоте; 12) груша; 13) фарфоровая тарелочка.

Работа 10. Открытие нитратов в тканях растений

ХОД РАБОТЫ

Внимание! Данный эксперимент надо проводить, соблюдая все правила предосторожности работы с концентрированной серной кислотой.

Исследовать разные растения, различные органы растений (стебель, лист, корень). Интенсивность посинения тканей позволяет приблизительно судить о количестве нитратов.

На фарфоровой тарелке разминают стеклянной палочкой часть растения и обливают раствором дифениламина в крепкой серной кислоте. В зависимости от содержания в соке азотной кислоты и ее солей, нитраты образуют синее окрашивание разной степени интенсивности (образуется анилин).

Используя обозначения («­» – нитратов нет, «+» – присутствие нитратов, «++» – много, «+++» – очень много нитратов), данные свести в таблицу.

Вид растения	Лист	Черешок	Стебель	Корень

Сделать выводы.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) проростки гороха или других растений; 2) 1-%-ный раствор дифениламина в крепкой серной кислоте; 3) фарфоровая тарелочка; 4) стеклянные палочки.

ТЕМА СЕДЬМАЯ

УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ

Способность к защите от неблагоприятных и повреждающих факторов среды – обязательное свойство организма растений (такое же, как и фотосинтез, минеральное питание, дыхание и т.д.). Ответные реакции, индуцируемые внешними воздействиями, часто объединяют терминами адаптационный синдром (adaptive syndrome) либо широко распространившимся ныне понятием стресс. Ганс Селье, впервые в 1936 г. предложивший этот термин, назвал комплекс ответных реакций организма «генерализованным адаптационным синдромом», в котором выделил три стадии:

1 стадия тревоги и торможения большинства процессов (для растений, не имеющих нервной системы, это первичная стресс-реакция, когда идут отклонения в физиолого-биохимических процессах);

2 стадия адаптации – когда идет выработка приспособления к стрессору;

3 стадия истощения – когда адаптивный потенциал организма достаточен или недостаточен для преодоления стресса. Если это происходит при сверхвысокой напряженности стресса – организм гибнет.

В последнее время показано, что изменения в метаболизме, физиологических функциях и ростовых процессах при стрессе связаны с изменениями экспрессии генов. Ответ на действие стрессора происходит если растение распознает стрессор, т.е. происходит первичная рецепция сигнала на клеточном уровне. Абиотические стресс-факторы (засоление, засуха, пониженная или повышенная температура и др.) обычно активизируют рецепторы, расположенные в плазмалемме, а далее через различные интермедиаты (протеинкиназы, фосфатазы) срабатывает сигнальная цепь, и образуются транскрипционные факторы, которые активируют в ядре гены путем связывания их со специфическими промоторами. Срабатывает последовательная цепь событий: стресс-сигнал → рецептор плазмалеммы → сигнальная цепь в цитозоле с ее усилением → активация транскрипционного фактора в ядре → промотр стресс-индуцированного гена → активация мРНК → стресс-белок → выполнение им защитной функции → приобретение растением устойчивости к данному сресс-фактору.

Подавляющая часть клеточных механизмов устойчивости сформировалась на ранних этапах эволюции и поэтому защитные системы проявляющиеся на клеточном уровне у высших растений и защитные системы примитивных организмов (дрожжей, бактерий, простейших) идентичны и имеют общую основу.

Под устойчивостью понимают способность растений сохранять постоянство протекания процессов и внутренней среды (поддерживать гомеорезис и гомеостаз) и осуществлять полный жизненный цикл в условиях действия стрессоров.

При действии стрессоров могут происходить изменения метаболических процессов, затрагивающие экспрессию генов, и растения приобретают устойчивость в онтогенезе, заложенную в генотипе (т.е. в пределах нормы реакции). Совокупность такого рода реакций называется акклимацией, она происходит при жизни организма и не наследуется. Ярким примером акклимации является закаливание. И очень часто выработка устойчивости в онтогенезу к одному стресс-фактору способствует перенесению отрицательного действия множества других. Например, предварительный тепловой шок растений хлопчатника защищал его от последующего засоления, прогрессирующей засухи, тяжелых металлов и ультрафиолетовой радиации (В.В. Кузнецов, 2007). Такое явление Генкель определял как «сопряженную» устойчивость, и в последнее время данное явление называют кросс-адаптацией.

Важную роль в устойчивости растений к стрессорам играют адаптации. В отличие от акклимации адаптации – наследственно закрепленный конститутивный признак, присутствующий в организме независимо от того, испытывает растение стрессовые условия или нет. Такие адаптации делают популяцию хорошо приспособленной к условиям окружающей среды. Такие адаптации проявляются как на морфологическом уровне (например, кактусы), так и на биохимическом (выработка токсичных алкалоидов у пасленовых против поедания фитофагами).

В заключение следует отметить, что именно устойчивость к неблагоприятным условиям среды определяет характер распределения различных видов растений по климатическим зонам Земли. Большинство же сельскохозяйственных культур вынуждены постоянно находиться в стрессовых ситуациях и поэтому обычно они реализуют лишь только 20% генетического потенциала продуктивности (С.С. Медведев, 2004). Для эффективного выращивания растений в условиях агрокультуры важна не только потенциальная продуктивность, но и высокая способность противостоять и успешно адаптироваться к неблагоприятным стрессовым сдвигам.

Работа 11. Криопротекторное действие углеводов и глицерина на цитоплазму

При воздействии отрицательных температур на растительные ткани в межклетниках образуется лед, который, оттягивая воду из клеток, обезвоживает протопласт. При определенной степени обезвоживания, характерной для каждого растительного организма, протоплазма коагулирует. Но еще хуже, когда кристаллы льда, образуются непосредственно в клетках.

Механическое воздействие льда нарушает внутреннюю субмикроскопическую структуру протоплазмы, резко повышая ее проницаемость, что при длительной экспозиции на морозе приводит к ее гибели.

Скорость отмирания протоплазмы зависит от температуры и времени экспозиции, и от водоудерживающей способности самой клетки. Увеличение количества растворимых углеводов в зимующих органах растений понижая водный потенциал повышает водоудерживающую способность тканей. Накопившиеся сахара, а также глицерин, обладая криопротекторными свойствами, обеспечивают более высокую зимостойкость растений.

ХОД РАБОТЫ

Из поперечного среза красной свеклы толщиной 0,5 см при помощи пробочного сверла диаметром 5-6 мм делают высечки. Тщательно ополаскивают их водой и помещают в три пробирки по 3-4 высечки в каждую. В первую пробирку наливают 5 мл дистиллированной воды, во вторую 5 мл 1 М раствора сахарозы, в третью – 5 мл 2 М раствора сахарозы, в четвертую – 12%-ный глицерин, в пятую – смесь 1:1 12%-ный глицерин и 2 М раствор сахарозы. Пробирки на 20 минут погружают в охладительную смесь до полного замораживания, состоящую изо льда или снега и поваренной соли в соотношении 3:1. Затем пробирки вынимают из охладительной смеси и размораживают в стакане с водой комнатной температуры.

Отмечают различия в интенсивности окрашивания жидкостей в пробирках, объясняют их. Из дисков готовят тонкие срезы и рассматривают их под микроскопом при малом увеличении в капле того же раствора, в котором они находились. Подсчитывают общее количество клеток в одном поле зрения и число обесцвеченных, из которых вышел антоциан, вследствие нарушения внутренней структуры протопласта при замерзании.

Результаты опыта заносят в таблицу:

Условия опыта	Число клеток в поле зрения микроскопа	Окрашенных клеток от общего количества	Выводы
всего	окрашенных
Дистиллированная вода
Сахароза 1 М
Сахароза 2 М
Глицерин 12%
Глицерин 12% + сахароза 2 М

Сделать выводы о протекторной роли сахарозы и глицерина и их смеси в сохранении жизнеспособности клеток.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) корнеплоды свеклы; 2) 1 и 2 М растворы сахарозы; 3) 12%-ный глицерин; 4) поваренная соль; 5) лед или снег; 6) термометры; 7) скальпели; 8) пробочные сверла диаметром 6 мм; 9) пробирки; 10) микроскопы; 11) предметные стекла; 12) кисточки; 13) фильтровальная бумага.

Работа 12. Накопление сахаров в растениях при понижении температуры окружающей среды

ХОД РАБОТЫ

Растирают два клубня картофеля, один из которых выдержан в течение двух недель до проведения работы в холодильнике при температуре +1-2⁰С. Сок отжимают через марлю и фильтруют. При помощи универсального рефрактометра определяют коэффициент преломления и концентрацию сахара в % в фильтрате, пользуясь таблицами Н.А.Гусева.

Заполняют таблицу:

Вариант	Коэффициент преломления	Концентрация сахара в %
Клубни картофеля при комнатной температуре
Клубни из холодильника

Аналогичные процессы происходят и в древесных растениях (береза, клен и др.) весной, когда теплые дни сменяют холодные ночи и в период возврата холодов (краткосрочных заморозков).

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) клубни картофеля, хранившиеся обычно, и выдержанные две недели в холодильнике; 2) рефрактометр; 3) терка; 4) марля; 5) пипетка; 6) таблицы Н.А. Гусева.

Работа 13. Защитное действие сахара на белки протоплазмы при отрицательных температурах

При действии экстремальных температур белки коагулируют. Интенсивность выпадения хлопьевидного осадка из вытяжки растительной ткани – показатель ее повреждения. Сахароза стабилизирует активную структуру белка, тем самым, защищая его от губительного действия отрицательных температур.

ХОД РАБОТЫ

Очищенный клубень картофеля натирают на терке, переносят на двойной слой марли и отжимают через нее сок в коническую колбу, и дают отстоятся крахмалу. Надосадочную жидкость наливают в три пробирки по 2,5 мл в каждую. В первую пробирку добавляют 2,5 мл дистиллированной воды, во вторую – 2,5 мл 0,5 М сахарозы, в третью – 2,5 мл 1 М сахарозы. Перемешивают содержимое в пробирках и ставят в охладительную смесь на 20 минут (см. работу 11).

Отстаивают пробирки в стакане с водопроводной водой, не встряхивая, сравнивают образование хлопьев коагулирующего белка. Пробирки зарисовывают, делают выводы о защитном действии сахарозы при замерзании растительных тканей.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) клубни картофеля; 2) 0,5 М и 1 М растворы сахарозы; 3) снег и поваренная соль; 4) терка; 5) марля; 6) конические колбы; 7) пробирки; 8) пипетки на 10 мл; 9) термометры.

Работа 14. Определение морозостойкости по степени проницаемости протоплазмы для электролитов

При действии низких температур происходят различные изменения физико-химических свойств клеточных мембран, в частности повышается их проницаемость для электролитов (потеря главного свойства – полупроницаемости).

ХОД РАБОТЫ

Растения выращивают до фазы 2-3 листьев. Первый этап закаливания проводят в течение 7 дней при 2 °С, второй – в течение 3 дней при -4 °С. Промораживанию подвергают отрезки стебля длиной 1-1,5 см при -7, -9, -15°С в течении 6 часов. После промораживания берут три навески растений по 0,5 г (по каждому варианту), помещают в ячейки для определения электропроводности и наливают одновременно 50 мл дистиллированной воды. Продолжительность экстракции 4 часа при комнатной температуре.

В качестве контроля используют значение электропроводности раствора, полученного при экзоосмосе (выхода электролитов) из убитых при кипячении тканей стебля. Для этого одну навеску растений (0,5 г) каждого варианта кипятят в пробирках с дистиллированной водой в течение 10 минут. Затем вынимают из кипящей воды и помещают одновременно с исследуемыми образцами для экзоосмоса в ячейки 50 мл дистиллированной воды. Выход электролитов определяют по сопротивлению растворов при помощи реохордного моста или кондуктометра. Для анализа полученных результатов используют относительную электропроводность – процент от уровня экзоосмоса электролитов из тканей убитых при кипячении.

Результаты заносят в таблицу.

Вариант	Электропроводность при температуре	Выводы
-7°С	-9°С	-15°С
1
2

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) растения 2-3 сортов, различающихся по устойчивости; 2) холодильные камеры; 3) весы; 4) пробирки; 5) реохордный мост или кондуктометр; 6) емкости для закаливания растений.

Работа 15. Определение жаростойкости растений (по Ф.Ф. Мацкову)

При повышении температуры выше оптимальной в растениях нарушается обмен веществ и, как следствие этого, накапливаются ядовитые вещества. При более высоких температурах резко повышается проницаемость цитоплазматических мембран, а затем наступает коагуляция белков и отмирание клеток.

Если подвергнуть лист действию высокой температуры, а затем погрузить в слабый раствор соляной кислоты, то поврежденные и мертвые клетки побуреют вследствие свободного проникновения в них кислоты, которая вызывает превращение хлорофилла в феофитин, тогда как неповрежденные клетки останутся зелеными. У растений, имеющих кислый клеточный сок, феофитинизация может произойти и без обработки соляной кислотой, так как при нарушении полупроницаемости мембран органические кислоты проникают из клеточного сока в хлоропласт, вытесняя магний из молекулы хлорофилла.

ХОД РАБОТЫ

Нагреть водяную баню до 40°С, погрузить в нее по 5 листьев исследуемых растений и выдержать листья в воде в течении 30 минут, поддерживая температуру на уровне 40°С. Затем взять первую пробу: вынуть по одному листу каждого вида растений и поместить их в чашку Петри с холодной водой (на чашке необходимо сделать соответствующую надпись). Поднять температуру в водяной бане до 50°С и через 10 минут после этого извлечь из бани еще по одному листу и перенести их в новую чашку с холодной водой. Так постепенно довести температуру до 80°С, беря пробы через каждые 10 минут при повышении температуры на 10°С.

Заменить воду в чашках 0,2 н соляной кислотой и через 20 минут учесть степень повреждения листа по количеству появившихся бурых пятен.

Результаты записать в таблицу, обозначив отсутствие бурения знаком слабое бурение – "+", побурение более 50% площади листа -"++" и сплошное побурение -"+++".

Объект	Степень повреждения листьев при
	40°С	50°С	60°С	70°С	80°С

Сделать выводы о степени жаростойкости исследованных растений.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) свежие листья каких-либо растений; 2) 0,2 н раствор соляной кислоты; 3) водяная баня; 4) термометр; 5) пинцет; 6) чашки Петри (5 шт.); 7) стакан с водой; 8) карандаш по стеклу.

Работа 16. Определение температурного порога коагуляции цитоплазмы (по П.А. Генкелю)

Клетки разных растений имеют различную жаростойкость. Температура, при которой в течение 10 минут происходит полная коагуляция белков цитоплазмы, считается условной границей жаростойкости растений. Гибель клеток устанавливается по потере или способности плазмолизироваться.

ХОД РАБОТЫ

Приготовить 12 срезов эпидермиса листа исследуемого растения и поместить по два среза в пробирки, в которые налито небольшое количество водопроводной воды.

Нагреть в большой колбе воду. Смешивая горячую воду с холодной приготовить в шести химических стаканах водяные бани с температурой 48, 50, 52, 54, 56 и 58°С (сделать на стаканах надписи карандашом по стеклу). Одновременно погрузить в водяные бани пробирки со срезами, поддерживая установленную температуру путем осторожного подливания в стаканы горячей воды. Через 10 минут извлечь срезы кисточкой из пробирок и перенести на предметные стекла, снабженные соответствующими надписями. Если клетки не содержат пигментов, следует окрасить их, выдержав в растворе нейтрального красного в течение 5-10 минут, затем отсосать раствор краски фильтровальной бумагой, нанести на срезы по капле 1 М раствора сахарозы, закрыть покровными стеклами и через 15-20 минут рассмотреть в микроскоп.

Записать результаты в таблицу, обозначая знаком "+" плазмолиз и знаком "-" его отсутствие. Каждый студент исследует один объект, а затем данные, полученные всей группой, записывают в таблицу.

Название растений	Температура, °С
48	50	52	54	56	58

Сделать выводы, сопоставляя температурный порог коагуляции белков цитоплазмы различных растений.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) свежие листья различных растений; 2) 1М раствор сахарозы в капельнице; 3) 0,02%-ный раствор нейтрального красного; 4) стаканы химические большие (6 штук); 5) пробирки (5 штук); 6) большая колба; 7) электроплитка или газовая горелка с треножником; 8) термометр; 9) лезвие бритвы; 10) препаровальная игла; 11) кисточка; 12) микроскоп; 13) предметные и покровные стекла; 14) кусочки фильтровальной бумаги; 15) карандаш по стеклу.

ТЕМА ШЕСТАЯ

ПРЕВРАЩЕНИЕ ВЕЩЕСТВ В РАСТЕНИЯХ

В целом обмен веществ – совокупность огромного числа физических и биохимических реакций, объединенных в пространстве и во времени в единое и упорядоченное целое, подчиняющееся законам термодинамики и обеспечивающее жизнедеятельность растения.

Работа 17. Получение амилазы из солода и обнаружение ее действия

ХОД РАБОТЫ

Половину чайной ложки солода растирают в ступке, приливают около 20 мл теплой воды, смесь взбалтывают и оставляют на 10 минут. Затем отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу. Первые порции мутного фильтрата сливают обратно на фильтр. В фильтрат перейдет фермент амилаза, расщепляющий крахмал.

Наиболее чувствительной цветной реакцией на крахмал и продукты его гидролиза является йодная проба. Для обнаружения действия амилазы берут слабый раствор йода, который готовят следующим образом: небольшое количество концентрированного раствора йода в йодистом калии приливают в колбочку и разбавляют дистиллированной водой до появления светло-желтой окраски. Приготовленный раствор разливают в два ряда пробирок (всего 20-24) по 5 мл. Берут 2 конические колбочки, наливают в них по 30 мл раствора крахмала, добавляют по 5 мл отфильтрованной солодовой вытяжки с амилазой. Одну колбочку оставляют на столе при комнатной температуре, а другую помещают в водяную баню, нагретую до 55°С. Во избежание разрушения фермента не следует допускать перегрева бани.

В первую пробирку каждого ряда приливают 1 мл через каждые 2 минуты и вносят в очередную пробирку с раствором йода соответствующего ряда. Йод будет окрашивать крахмал и продукты его гидролиза в разные цвета: в типично синий, характерный для неизмененного крахмала, затем в сине-фиолетовый и темно-фиолетовый (амилодекстрины), красно-бурый (эритродекстрины) и желтый (ахродекстрины). Получается как бы цветная шкала постепенного гидролиза крахмала.

Когда внесенная проба (1 мл) уже не будет изменять светло-желтой окраской йода, это указывает на окончание гидролиза крахмала, из колбочки берут 2 мл раствора, переносят в пробирку и добавляют такое же количество фелинговой жидкости. Образование кирпичного красного осадка закиси меди после кипячения содержимого пробирки свидетельствует о присутствии низкомолекулярных восстанавливающих (редуцирующих) сахаров в испытуемом растворе появившихся в результате гидролиза крахмала.

Аналогичную реакцию проводят с исходным крахмалом.
Время окончания его гидролиза в первой и во второй
колбочках дает возможность судить о скорости процессов при
разных температурах. Результаты опыта учитывают по схеме:

Условия опыта	Окраска раствора йода в пробирках	Начало опыта	Окончание опыта	Время гидролиза
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Комнатная температура
Температура 55°С

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) солод; 2) 2%-ный раствор крахмала; 3) раствор йода в йодистом калии; 4) пипетки на 1 мл, 20 мл; 5) термометр; 6) штатив с пробирками; 7) воронки; 8) фильтры; 9) жидкость Фелинга; 10) водяная баня.

Работа 18. Выделение β-фруктофуранозидазы из дрожжей и ферментативный гидролиз сахарозы

Данный фермент (прежнее название инвертаза или сахараза) разлагает сахарозу на фруктозу и глюкозу (инвертный сахар):

С₁₂Н₂₂О₁₁ + Н₂О = С₆Н₁₂О₆ + С₆Н₁₂О₆

сахароза глюкоза фруктоза

ХОД РАБОТЫ

2-3 г прессованных дрожжей смешивают с 2-3 г кварцевого песка, доливают 5 мл воды и тщательно растирают в фарфоровой ступке. Затем приливают еще 15 мл воды, нагретой до 40°С, и продолжают растирание в течение 10 минут. Раствор профильтровывают через складчатый фильтр. Первые порции мутного фильтрата сливают снова на фильтр. На фильтре будет находиться β-фруктофуранозидаза, расщепляющая сахарозу на глюкозу и фруктозу.

В три пробирки помещают по 5 мл 2%-ного раствора сахарозы. Одну оставляют для контроля, во вторую приливают 1 мл фильтрата, в третью также 1 мл фильтрата, но предварительно прокипяченного. Пробирки ставят в водяную баню с температурой 40°С. Через 15-20 минут в них добавляют 5 мл реактива Фелинга, а затем содержимое следует хорошо прокипятить на горелке. В присутствии восстанавливающих сахароз выпадает кирпично-красный осадок закиси меди (Сu₂О).

На основании результатов реакции делают заключение о
действии фермента β-фруктофуранозидазы и о влиянии на
его активность высокой температуры.

Результаты записывают по схеме:

Вариант	Состав смеси в пробирке, мл	Результат
сахароза, 2%-ный р-р	фильтрат – носитель фермента
без кипячения	после кипячения
1	5	-	-
2	5	1	-
3	5	-	1

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) дрожжи прессованные; 2) ступка; 3) кварцевый песок; 4) воронки; 5) штатив с пробирками; 6) водяная баня; 7) 2%-ный раствор сахарозы; 8) реактив Фелинга; 9) пипетки; 10) фильтровальная бумага.

Работа 19. Определение активности липаз в процессе прорастания семян

При прорастании семян масличных растений, отличающихся высоким содержанием триглицеридов, отмечается быстрое уменьшение содержания жиров и одновременно увеличивается концентрация сахарозы. Образование углеводов из жиров – многоэтапный процесс, четко разграниченный в пространстве и во времени. С момента начала набухания семян масличных культур первым ферментом, атакующим молекулу жира (триглицерида), является нейтральная липаза. Установлено, например, что в семенах клещевины эта липаза активируется одной из протеиназ, присутствующих в эндосперме.

Липаза ступенчато гидролизует триглицерид до диглицерида, моноглицерида и, наконец, до свободного глицерина и жирных кислот.

Липазы, присутствующие в семенах масличных растений, проявляют активность при различных значения рН. Поэтому иногда употребляют названия нейтральной, кислой и щелочной липазы. Наиболее активными в семенах масличных является кислая и щелочная липазы. Определение их активности основано на учете концентрации жирных кислот, образующихся при действии на чистый препарат какого-либо жира (масла) экстрактом липаз, выделенным из семян разных периодов проращивания.

ХОД РАБОТЫ

Для навески очищенных от кожуры прорастающих семян подсолнечника (по 3 г каждая) помещают в фарфоровые ступки, приливают по 1 мл чистого подсолнечного масла и тщательно растирают в течение 3-4 минут. Затем в одну из ступок приливают 6 мл ацетатного буфера с рН=4,7, а в другую – 5 мл боратного буфера с рН=8,5 и продолжают растирание в течение 2 минут. Затем содержимое ступок количественно переносят в две конические колбы емкостью 100 мл. Ступку и пестик ополаскивают 5 мл воды, сливая промывные воды в соответствующую колбу, добавляют по 5 капель толуола, плотно закрывают пробками и ставят на ротатор, где перемешивают в течение 30 минут. После этого колбы ставят на 20 часов в термостат, нагретый до 30 °С.

Одновременно готовят две контрольные пробы (для каждого рН), с которым проделывают те же операции, что и при исследовании образцов, однако перед помещением контрольных колб в термостат их содержимое кипятят 5-10 минут на электроплитке для инактивации липаз.

Через 20 часов (на следующий день) колбы вынимают из
термостата, приливают в каждую из них по 50 мл смеси
этилового спирта с эфиром в соотношении 4:1, встряхивают и дают несколько минут отстояться. Далее добавляют по 4-5 капель тимолфталеина и содержимое колб титруют 0,1 н спиртовым раствором NaOH. Активность кислых и щелочных липаз выражают в миллилитрах 0,1 н NaOH, пошедшей на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся в результате действия липаз на 1 г семян.

Результаты рассчитывают по формуле:

где АЛ – активность липазы (кислой или щелочной);

а и в – количество 0,1 н NaOH, затраченное на титрование опытного и контрольного образцов, мл;

Т – поправка к титру 0,1 н раствора NaOH;

Н – навеска семян, г.

Заполняют таблицу:

№ п/п	Объект исследования, рН	Навеска материала, (Н),г	Пошло на титрование 0,1 н р-ра NaOH, мл	Активность липазы (АЛ), мл 0,1н NaOH/г
исследуе­мого р-ра (а)	контроль­ного р-ра (в)
1
2
3
4

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) семена подсолнечника, отобранные в различные периоды прорастания; 2) ацетатный буфер с рН=4,7; 3) боратный буфер с рН=8,5; 4) подсолнечное масло; 5) 0,1 н спиртовой раствор NaOH; 6) смесь этилового спирта с эфиром (4:1); 7) толуол; 8) 1%-ный спиртовый раствор тимолфталеина; 9) фарфоровые ступки с пестиком; 10) конические колбы на 100 мл; 11) мерные цилиндры на 10 и 50 шт.; 12) ротатор; 13) аналитические весы; 14) термостат; 15) электроплитка.

Работа 20. Превращение запасных веществ при прорастании семян

ХОД РАБОТЫ

Растереть в четырех ступках непроросшие и проросшие семена – крахмалистые (пшеница) и маслянистые (клещевина). Маслянистые семена перед измельчением желательно очистить от кожуры. Поместить материал в разные пробирки, залить небольшим количеством воды, нагреть в кипящей водяной бане. Слить вытяжки в чистые пробирки, прилить равный объем реактива Фелинга и довести до кипения.

По количеству образовавшейся закиси меди дать оценку содержания редуцирующих сахаров. К оставшемуся в пробирках материалу (мезге) прилить раствор йода и по интенсивности посинения дать оценку содержания крахмала.

Сделать тонкие срезы непроросших и проросших маслянистых семян, поместить на предметные стекла в капли раствора Судан III, закрыв покровными стеклами.

Через 5 минут промыть срезы водой, рассмотреть в микроскоп и дать оценку содержания жира – по количеству и размерам капель, окрашенных в красный или оранжевый цвет.

Нанести в капли на предметные стекла небольшое количество эндосперма непроросших и проросших семян пшеницы (не подвергавшихся нагреванию), рассмотреть в микроскоп и зарисовать крахмальные зерна.

Результаты записать в таблицу, оценивая содержание
соответствующих веществ в баллах.

Семена	Крахмал	Жир	Редуцирующие сахара
Крахмалистые непроросшие
Крахмалистые проросшие
Маслянистые непроросшие
Маслянистые проросшие

Сделать выводы о превращении веществ при прорастании крахмалистых и маслянистых семян.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) семена различных растений (сухие и проросшие); 2) фильтровальная бумага; 3) краситель Судан III; 4) реактив Фелинга; 5) водяная баня; 6) йод в йодистом калии.

Пётр Арамаисович Иконников

Анна Алексеевна Белозёрова

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

Учебно-методический комплекс

Практикум для студентов

специальностей 020201.65 «Биология», 020803.65 «Биоэкология» и направления 020200.62 «Биология» (бакалавр)

Подписано в печать __________ г. Тираж _______экз.

Объем _______ п.л. Формат 60х84/16 Заказ № ________

Издательство Тюменского государственного университета

625003, г. Тюмень, Семакова, 10