Основы молекулярной биологии и генетики

---

Коррекция осу­ществляется в тех случаях, когда к З’-концу расту­щей цепи присоединяется «неправильный» нуклеотид, неспособный образовать нужные водородные связи с матрицей. Когда pol III ошибочно при­соединяет неправильное основание, «включается» ее 3′ -» 5′-экзонуклеазная активность, и это основа­ние немедленно удаляется, после чего восстанавли­вается полимеразная активность. Такой простой механизм действует благодаря тому, что pol III способна работать как полимераза лишь на совер­шенной двойной спирали ДНК с абсолютно пра­вильным спариванием оснований.

Еще один механизм удаления РНК-фрагментов основан на присутствии в клетках особой рибонуклеазы, получившей название РНКазы Н. Этот Ф специфичен к двунитевым структурам, построенным из одной рибонуклеотидной и одной дезоксирибонуклеотидной цепи, причем он гидролизует первую из них.

РНКаза Н также способна удалять РНК-праймер с последующей за­стройкой разрыва с помощью ДНК-полимеразы. На заключительных этапах сборки фрагментов в нужном порядке действует ДНК-лигаза, катализирующая образование фосфодиэфирной связи.

Раскручивание геликазами части двойной спирали ДНК в хромо­сомах эукариот приводит к сверхспирализации остальной части струк­туры, что неизбежно сказывается на скорости процесса репликации. Сверхспирализации препятствуют ДНК-топоизомеразы.

Таким образом, в репликации ДНК, помимо ДНК-полимеразы, принимает участие большой набор Ф: геликаза, праймаза, РНКаза Н, ДНК-лигаза и топоизомераза. Этим перечень Ф и белков, участвую­щих в матричном биосинтезе ДНК, далеко не исчерпывается. Однако многие из участников этого процесса до настоящего времени остают­ся мало изученными.

В процессе репликации происходит «корректорская правка» – удаление непра­вильных (образующих некомплементарные пары) оснований, включенных во вновь синтезированную ДНК. Этот процесс обеспечивает чрезвычайно вы­сокую точность репликации, отвечающую одной ошибке на 109 пар оснований.

Теломеры. В 1938г. классики генетики Б.Мак-Клинтон и Г. Мёллер доказали, что на концах хромосом есть специальные структуры, которые назвали теломерами (телос-конец, мерос-часть).

Ученые обнаружили, что при воздействии рентгеновским облучением устойчивость проявляют лишь теломеры. Напротив, лишенные концевых участков, хромосомы начинают сливаться, что ведет к тяжелым генетическим аномалиям. Т.о., теломеры обеспечивают индивидуальность хромосом. Теломеры плотно упакованы (гетерохроматин) и малодоступны для ферментов (теломеразы, метилазы, эндонуклеаз и др.)

Функции теломер.

1.Механические: а) соединение концов сестринских хроматид после S-фазы; б) фиксация хромосом к ядерной  мембране, что обеспечивает конъюгацию гомологов.

2.Стабилизационные: а) предохранение от недорепликации генетически значимых отделов ДНК (теломеры не транскрибируются); б) стабилизация концов разорванных хромосом. У больных  α – талассемией в генах  α – глобина происходят разрывы хромосомы 16д  и к поврежденному концу добавляются теломерные повторы (ТТАГГГ).

3.Влияние на экспрессию генов. Активность генов, расположенных рядом с теломерами, снижена. Это проявление сайленсинга – транскрипционное молчание.

4.«Счетная функция». Теломеры выступают в качестве часового устройства, которое отсчитывает количество делений клетки. Каждое деление укорачивает теломеры на 50-65 н.п. А всего их длина в клетках эмбриона человека составляет 10-15 тысяч н.п.

Теломерная ДНК попала в поле зрения биологов совсем недавно. Первые объекты исследования – одноклеточные простейшие – ресничная инфузория (тетрахимена), которая содержит несколько десятков тысяч очень мелких хромосом   и, значит, множество теломер в одной клетке (у высших эукариот менее 100 теломер на клетку).

В теломерной ДНК инфузории многократно повторяются блоки из 6-ти нуклеотидных остатков. Одна цепь ДНК содержит блок  2 тимин – 4 гуанин (ТТГГГГ   –   Г-цепь), а комплементарная цепь  –   2 аденин – 4 цитозин (ААЦЦЦЦ  – Ц-цепь).

Каково же было удивление ученых, когда обнаружили, что теломерная ДНК человека отличается от таковой у инфузории всего лишь одной буквой и образует блоки  2 тимин – аденин – 3 гуанин (ТТАГГГ). Более того, оказалось, что из ТТАГГГ – блоков построены теломеры  (Г – цепь) всех млекопитающих, рептилий, амфибий, птиц и рыб.

Впрочем, удивляться здесь нечему, так как в теломерной ДНК не закодировано никаких белков (она не содержит гены). У всех организмов теломеры выполняют универсальные функции, речь о которых шла выше. Очень важная характеристика теломерных ДНК – их длина. У человека  она колеблется от 2 до 20 тысяч пар оснований, а у некоторых видов мышей может достигать сотен тысяч н.п. Известно, что около теломер есть специальные белки, обеспечивающие их работу и участвующие в построении теломер.

Доказано, что для нормального функционирования каждая линейная ДНК должна иметь две теломеры: по одной теломере на каждый конец.

У прокариот теломеров нет – их ДНК замкнута в кольцо.

Репликация  теломерных отделов ДНК.

1) Проблему сформулировал А.М.Оловников в 1971 году только для линейных ДНК – новые цепи оказываются укороченными с 5′  концов.

2) Недорепликация ДНК ведет к старению клетки.

ДНК – полимераза только удлиняет 3′ конец уже имеющегося полинуклеотида, а здесь такого конца просто нет – значит, новая цепь должна быть несколько короче старой. Образуются острые (50-65 н.п.) концы ДНК, которые обрезаются эндонуклеазами.

3) В среднем в 1 молекуле яд-ДНК 120 млн. н.п., значит, укорочение ДНК за одно клеточное деление составит ~ 0,00005%. Таким образом, если бы концы не восстанавливались, то через определенное количество делений хромосомы вообще исчезли бы!

Решение проблемы концевой недорепликации:

1) На концах хромосомной ДНК есть гексануклеотидная  последовательность без информации:

5′  ЦЦЦТАА →                                   ТТАГГГ  3′

3′     ГГГАТТ      ←                    ←     ААТЦЦЦ 5′

У 3′  конца цепи  5′  ТТАГГГ  3′   эти повторы у эмбриона человека составляют 10-15 тысяч н.п. (0,02%). Если теряются эти буферные участки, то это не отражается на функции генома.

2) Удлинение теломер с помощью теломеразы (1984 г., Блэкберн, Грайдер).

Удлиняется старая цепь, более длинная (до обрезания острого конца!). К 3′-концу старой цепи пристраиваются несколько сотен  ТТАГГГ –  повторов, которые являются матрицей для образования еще одного фрагмента Оказаки.

3) Механизм ALT (альтернативный механизм) – без теломеразы у дрозофилы и некоторых раковых клеток – рекомбинация между теломерными участками разных хромосом и удлинение ДНК путем рекомбинации! Но роль ALT невелика!

Концевая недорепликация ДНК.

Известно, что ДНК-полимеразы, синтезируя дочернюю цепь ДНК, прочитывают родительскую цепь в направлении от ее 3 –конца к 5 -концу. Соответственно дочерняя цепь синтезируется в направлении 5′ → 3′.

В противоположном направлении синтез цепи ДНК фермент катализировать не может. Кроме того, ДНК-полимераза начинает синтез только со специального  РНК-праймера — короткой РНК-затравки, комплементарной ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК заполняются ДНК-полимеразой. Однако на 3′-конце ДНК такой пропуск заполнен быть не может, и поэтому 3′-концевые участки ДНК остаются однотяжевыми, а их 5′-концевые участки — недореплицированными. Отсюда ясно, что каждый раунд репликации хромосом будет приводить к их укорочению. Понятно, что, прежде всего, должна сокращаться длина теломерной ДНК.

Этим-то и объясняется «лимит Хейфлика», так как после того, как  длина теломерной  ДНК становится угрожающе низкой, наступает период кризиса—неспособности клетки к дальнейшему делению, а затем и её смерть. Хотя в культурах клеток in vitro клетки и погибают от укорочения теломер, но для клеток in vivо нормального организма это практически невозможно. Так, согласно недавним наблюдениям Озавы (1997) 89% митохондриальной ДНК в митохондриях сердца 97- летнего старика содержали обширные делеции, критичные для репликации и транскрипции. Тем не менее, этот человек умер не от сердечной недостаточности, а от рака желудка. Нетрудно представить себе, что дальнейшее нарастание дисфункции митохондриальной ДНК всё же привело бы старика в недалёком будущем к смерти и это вряд ли имело отношение к укорочению ядерной ДНК.

Как отмечалось, первым на проблему «концевой недорепликации ДНК» обратил внимание А.М. Оловников в 1971 году. Он высказал гипотезу о том, что потеря концевых последовательностей ДНК вследствие их недорепликации ведет к старению клетки. Предполагалось, что процесс укорочения теломер и есть тот часовой механизм, который определяет репликативный потенциал «смертной» клетки, и когда длина теломер становится угрожающе короткой, этот механизм предотвращает дальнейшее деление клетки. А.М.Оловников предположил также, что в нестареющих клетках (а к ним кроме раковых относятся зародышевые, стволовые и другие генеративные клетки) должна существовать специализированная ферментативная система, которая контролирует и поддерживает длину теломерной ДНК.

Гипотеза А.М. Оловникова нашла убедительное подтверждение в последующие годы. Во-первых, было установлено, что теломеры нормальных (то есть обреченных на старение) клеток действительно укорачиваются на 50-60 нуклеотидных звеньев при каждом клеточном делении. Во-вторых, в 1984 году Э. Блэкберн и Э. Грайдер выделили фермент, который с помощью механизма, отличного от механизма реакций, лежащих в основе репликации ДНК, синтезирует теломерную ДНК. Этот фермент был назван  теломеразой. Итак, основное назначение теломеразы — синтезировать повторяющиеся сегменты ДНК, из которых состоит Г-цепь теломерной ДНК. Таким образом, она относится к классу ДНК-полимераз, причем оказалось, что теломераза — это РНК-зависимая ДНК-полимераза или обратная транскриптаза. Ферменты этого класса, синтезирующие ДНК на РНК-матрицах, очень хорошо известны молекулярным биологам. Они закодированы и содержатся в ретровирусах (например, в вирусе иммунодефицита человека, вызывающем заболевание СПИДом) и служат для синтеза ДНК-копий их геномов, который в ретровирусе представлен РНК. В клеточном геноме обратные транскриптазы закодированы в ретротранспозонах.

РНК, используемая теломеразой для синтеза теломерной ДНК в качестве матрицы, входит в состав этого фермента. В этом уникальность теломеразы: на сегодня это единственная известная РНК-содержащая обратная транскриптаза. Теломеразные РНК у разных организмов сильно различаются по длине и структуре.

Теломеразы простейших содержат РНК длиной в 150—200 нуклеотидных остатков (н.о.), длина теломеразной РНК человека — 450 н.о., в то время как теломераза дрожжей содержит аномально длинную РНК (около 1300 н.о.).

Матричный участок представлен в теломеразной РНК только один раз. Его длина не превышает длину двух повторов в теломерной ДНК, которые он кодирует и которым он комплементарен.

Так как теломераза синтезирует сегменты ДНК, повторяющиеся много раз, используя только один сегмент своей РНК, она должна обладать способностью периодически (после завершения синтеза каждого повтора) перемещать (транслоцировать) матричный участок в район 3′-конца синтезируемой теломерной ДНК. Источником энергии для такого перемещения, по-видимому, служит сама реакция синтеза цепи теломерной  ДНК,  поскольку дезоксинуклеозидтрифосфаты  — субстраты  этой  реакции — высокоэнергетические вещества.

На первой стадии теломераза находит З’-конец теломерной ДНК, с которым часть матричного участка теломеразной РНК образует комплементарный комплекс. При этом теломераза использует З’-конец хромосомной ДНК в качестве праймера. Далее наступает очередь РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности теломеразы. 

Рис.10. Механизм действия теломеразы

Она обеспечивается специальной субъединицей теломериразы, которая по устройству своего каталитического центра во многом сходна с обратными транскриптазами ретровирусов и ретротранспозонов. Когда синтез ДНК-повтора заканчивается, происходит транслокация, то есть перемещение матрицы и белковых субъединиц фермента на заново синтезированный конец теломерной ДНК, и весь цикл повторяется вновь (рис.10).

Это схематичное представление является весьма условным, так как для построения теломер требуется еще много субъединиц, например, отвечающих за нахождение 3′-конца ДНК, или субъединицы, отвечающие за транслокацию, и т.д.

Теломераза, рак и старение. Рассмотрим данные о длине теломерной ДНК и активности теломеразы в различных клетках человека.

Высокая теломеразная активность наблюдается в половых клетках человека в течение всей его жизни (табл.1). Соответственно их теломеры состоят из наибольшего числа ДНК-повторов и содержат все необходимые белки для нормальной репликации клеток.

Табл.1. Теломеразная активность различных клеток

Аналогичная ситуация наблюдается и для стволовых клеток, которые делятся неограниченно долго. Однако у стволовой клетки всегда есть возможность дать две дочерние клетки, одна из которых останется стволовой («бессмертной»), а другая вступит в процесс дифференцировки. Благодаря этому стволовые клетки служат постоянным источником разнообразных клеток организма. Например, стволовые клетки костного мозга дают начало гемопоэзу — процессу образования клеток крови, а из базальных клеток эпидермиса происходят разнообразные клетки кожного покрова. Как только потомки половых или стволовых клеток начинают дифференцироваться, активность теломеразы падает и их теломеры начинают укорачиваться. В клетках, дифференцировка которых завершена, активность теломеразы падает до нуля, и с каждым клеточным делением они с неизбежностью приближаются к состоянию сенесенса (перестают делиться). Вслед за этим наступает кризис, и большинство клеток погибает. Эта картина характерна для подавляющего большинства известных культур клеток эукариот. Однако и здесь есть редкие, но важные исключения: теломеразная активность обнаруживается в таких «смертных» клетках, как макрофаги и лейкоциты.

Недавно было установлено, что нормальные соматические клетки потому лишены теломеразной активности, что в них полностью подавлена экспрессия гена ее каталитической субъединицы (обратной транскриптазы). Другие же составляющие теломеразы, включая теломеразную РНК, образуются в этих клетках, хотя и в меньших количествах, чем в их «бессмертных» прародителях, но постоянно. Открытие этого важного факта Дж. Шеем, В. Райтом и их сотрудниками и стало основой для сенсационной работы по преодолению «лимита Хейфлика».

Сравнительно небольшая длина теломер у большинства раковых клеток наводит на мысль о том, что они происходят из нормальных клеток, достигнувших предкризисного состояния. Это состояние характеризуется нарушением регуляции многих биохимических реакций. В таких клетках происходят многочисленные хромосомные перестройки, которые в том числе ведут и к злокачественной трансформации. Большинство этих клеток погибают, но в части из них в результате случайных мутаций может активироваться постоянная экспрессия генов теломеразы, которая будет поддерживать длину теломер на уровне, необходимом и достаточном для их функционирования.

Некоторое время вызывал недоумение тот факт, что примерно пятая часть проанализированных раковых опухолей и клеток вообще не содержала активной теломеразы. Оказалось, однако, что длина теломер в них поддерживается на должном уровне. Таким образом, в этих клетках действует другой (не теломеразный, а скорее рекомбинационный) механизм образования теломерной ДНК. Иными словами, такие клетки находятся в том же ряду исключений из правила, что и дрозофила.

В последнее время проводится много работ, аналогичных работе Дж. Шея, В. Райта. Были сообщения о том, что клетки с искусственно активированной теломеразой преодолели 220 циклов деления. Последние сообщение пришло из Юго-Западного Медицинского Центра в Далласе; в нём говорится, что уже 220 поколений клеток преодолели 70-75 циклов деления.

Репарация и заболевания человека как результат нарушения репарации. Для сохранения основных характеристик клеток и организмов данной популяции необходимо точное сохранение структуры и стабильности функции генетического материала на протяжении тысяч и милли­онов лет, несмотря на действие различных мутагенных факторов. Существует несколько причин высокой стабильности структуры и функций ДНК. Во-первых, это высокая химическая стабильность самой молекулы ДНК, а во-вторых, это наличие cпeциaльных мexaнизмoв репарации возникающих изменений. Широкий набор различных репликационных ферментов осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК и удаление из нее поврежденных нуклеотидов. Способность клеток к исправлению повреждений в молекулах ДНК получила название репарации (лат.: reparatio — восстановление). Наследственная информация представлена в ДНК в виде цепей двойной спирали ДНК. Благодаря этому случайное повреждение в одной из цепей может быть исправлено репликационным ферментом, и данный участок цепи восстановлен в своем нормальном виде за счет информации, содержащейся в неповрежденной цепи.

Классификация репараций. По времени осуществления в клеточном цикле различают дорепликативную, репликативную и пострепликативную репарацию.

Дорепликативная репарация. Это процесс восстановления по­врежденной нити ДНК до ее удвоения. В простейших случаях разрывы могут быть воссоединены ферментом лигазой. В других случаях ис­пользуется полная ферментативная система эксцизионной или неэксцизионной репарации.

Репликативная репарация. Это совокупность процессов восста­новления ДНК в ходе репликации. При этом поврежденный участок удаляется в ходе репликации в зоне роста цепи. В обеспечении высокой точности репликации большая роль принадлежит механизму само­коррекции, осуществляемому ДНК-полимеразой или тесно связанной с ней ферментом эндонуклеазой. Этот процесс связан с определением ошибочно включенного в цепь нуклеотида, отщеплением его и заменой на соответствующий. В результате этого частота ошибок снижается  в10 раз (с 10-⁵до 10-⁶ ).

Пострепликативная репарация. Ее механизм точно не изучен. При пострепликативной репарации происходит вырезание повреж­денного участка, что изменяет ген. При этом клетка может сохранять жизнеспособность и передавать дефектную ДНК дочерним клеткам. Предполагают возможность наличия различных вариантов синтеза ДНК на поврежденной матрице.

По механизмам осуществления репарация подразделяется на: неэксцизионную репарацию и эксцизионную (вырезающую) репарацию.

Неэксцизионная репарация. Фоторепарация. В результате ультрафиолетового облучения целостность молекул ДНК нарушается, так как в них возникают димеры, т. е. сцепленные между собой соседние пиримидиновые основания. Димеры могут формироваться между двумя тиминами, тимином и цитозином, двумя цитозинами, тимином и урацилом, двумя урацилами. Однако, облученные клетки, на свету выживают гораздо лучше, чем в темноте. После тщательного анализа причин этого явле­ния, установлено, что в поврежденных клетках на свету происходит репарация ДНК (фоторепарация). Она осуществляется специальным ферментом ДНК-фотолигазой, активирующейся квантами видимого света. Фермент соединяется с поврежденной ДНК, разъединяет возникшие в димерах связи и восстанавливает целостность нити ДНК. Фотоактивируемый фермент ДНК-фотолигаза не является видоспецифичным, т. е. действует на разные виды ДНК. В качестве кофермента в нем имеется цианокобаламин (вит. В|2), поглощающий кванты видимого света и передающий энергию молекуле фермента. При неэксцизионной световой репарации исправляются поврежде­ния, возникшие только под воздействием ультрафиолетовых лучей. На ранних стадиях эволюции живых организмов, когда отсутствовал озоновый экран, задерживающий большую часть потока губительных для организмов солнечных ультрафиолетовых лучей, фоторепарация играла особенно важную роль.

Деалкилирование гуанинов. Если структура ДНК изменена в ре­зультате присоединения к гуанину метиловых или этиловых групп, то репарацию осуществляет фермент гуанин-алкилтрансфераза. Этот фермент отделяет указанные группы и присоединяет их к себе, после чего структура поврежденного участка ДНК восстанавливается.

При эксцизионной (вырезающей) репарации устраняются по­вреждения, появившиеся под влиянием ионизирующей радиации, химических веществ и других факторов. Это основной тип репарации, который обнаружен как у прокариот, так и в клетках эукариот (рис.11). Ме­ханизм эксцизионной репарации ДНК отличается тем, что не только разрезаются димеры (как при световой), но и вырезаются большие участки молекулы ДНК (до нескольких сотен нуклеотидов). Видимо могут удаляться целые гены, после чего происходит репаративный комплементарный матричный синтез с помощью фермента ДНК-полимеразы.