Диагностика паразитозов (Карасев Н.Ф.)

---

Взятие и доставка в лабораторию проб фекалий

Рукой в резиновой перчатке берут примерно 100 г фека­лий из прямой кишки животных или только что выделивших­ся при испражнении. В последнем случае берут пробу с верх­ней части экскрементов, не соприкасавшейся с полом или поч­вой. Руку и пинцет после взятия каждой пробы тщательно моют. Пробы от мелких животных берут с помощью груши. Вращательными движениями наконечник груши вводят в пря­мую кишку. При сдавливании груши воздух входит в кишку. Затем наконечник груши вынимают. Эта манипуляция вы­зывает рефлекторный акт дефекации. После каждого взятия пробы наконечник груши тщательно промывают. Взятый материал регистрируют в описи сопроводительного доку­мента.

Каждую пробу помещают в пакетик из плотной бумаги или целлофановый, нумеруют и отправляют в лабораторию с описью в сопроводительном документе. В нем указывают хозяйство, отделение или владельца животных, вид и количество их в стаде (отаре, табуне), дату взятия проб и цель исследо­вания.

В лабораторию отправляют пробы не более суточной дав­ности со времени их взятия. При исследовании на диктиокаулез и стронгилоидоз пробы следует доставлять в лабораторию не позже чем через 4 ч после взятия.

Если нет возможности своевременно доставить пробы в лабораторию, их можно консервировать, используя для этой цели физические и химические методы консервации.

Из физических методов наиболее распространенным и простым является воздействие низких температур. Пробы по­мещают в холодильник при температуре +2…-4°С, что задерживает развитие личинок.

Можно использовать и различные химические средства:

ü жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина в изо­тоническом растворе натрия хлорида). В ней пробы фекалий могут сохраняться до двух недель;

ü смесь, состоящую из формалина (5 мл), глицерина (5 мл) и воды (100 мл);

ü смесь, состоящую из 0,2%-ного натрия азотнокислого (1900 мл), раствора Люголя (250 мл), формалина (300 мл) и глицерина (25 мл).

Гельминтоскопия

Для обнаружения гельминтов в фекалиях их смешивают с водой (1:10) и смеси дают отстояться. Через некоторое вре­мя (не менее 5 мин) верхний слой воды сливают, а к осадку приливают новую порцию воды. Так повторяют несколько раз, что позволяет удалить большую часть посторонних веществ, а в осадке остаются паразиты и нерастворимые тяжелые час­ти фекалий. Затем осадок исследуют макро- и микроскопи­чески.

Макроскопическое исследование. Промытый осадок фе­калий вновь разбавляют водой, небольшими порциями нали­вают в черную кювету и при медленном покачивании ее вни­мательно просматривают осадок. Можно брать осадок неболь­шими порциями, выливать в чашки Петри и просматривать под лупой или микроскопом. Некоторых гельминтов лучше просматривать на белом фоне. Поэтому рекомендуют одну половину кюветы окрашивать в черный цвет, другую – в бе­лый. Так последовательно просматривают весь материал. Обнаруженных паразитов выбирают препаровальной иглой или кисточкой и фиксируют.

Микроскопическое исследование. Для обнаружения мел­ких форм паразитов отмытый осадок исследуют в бактерио­логических чашках с помощью штативной лупы (6-10-крат­ное увеличение).

Гельминтоовоскопия

Оборудование и средства. Для проведения гельминтоовоскопии необходимо следующее оборудование и материалы: микроскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологичес­кий стереоскопический (МБС), предметные и покровные стек­ла, бактериологические чашки, пинцеты, ножницы, стеклянные палочки, фарфоровые ступки и пестики, стаканчики из стекла или синтетического материала с верхним диаметром 4-5 см (мензурки в форме усеченного конуса на 50 мл), можно ис­пользовать баночки Флоринского, ситечки с металлической или покровной сеткой (кусочки чулочной ткани или марли) с ве­личиной сторон ячеек 0,25-0,3 мм, центрифужные пробирки, центрифуга до 2 тыс. об/мин, металлические петли с диамет­ром кольца 5-8 мм, спиртовая или газовая горелка, флотаци­онные растворы, десенсиметр для проверки плотности флота­ционных растворов, глицерин, молочная кислота, глазные пипетки, целлофановая пленка.

Приготовление флотационных растворов. Насыщенный раствор натрия хлорида (NaCl). В эмалированное ведро с кипящей водой порциями кладут соль, постоянно помешивая деревянной лопаточкой до полного ра­створения. Соль добавляют до тех пор, пока она не начинает выпадать в осадок. Для приготовления раствора требуется 420 г соли на 1 л воды. В горячем виде раствор фильтруют через марлю. При остывании раствора кристаллы хлорида натрия выпадают в осадок, что свидетельствует о плотности насыщенного раствора, равной 1,18-1,20.

Раствор свинца нитрата (азотнокис­лого свинца) (Pb(NO₃)₂). Соль растворяют в горячей воде порциями при подогревании и постоянном помешивании до полного растворения. На 1 л воды требуется 650 г соли. Фильтровать раствор не обязательно. Плотность насыщенно­го раствора 1,5. Он обладает высокой флотационной способностью. Однако уже через 24 ч после приготовления плот­ность несколько падает за счет выпадения частиц соли в оса­док. Поэтому перед употреблением раствор подогревают с размешиванием осадка. Плотность уточняют десенсиметром.

Нитрат свинца – соль тяжелого металла, при работе с ним следует соблюдать осторожность.

Раствор аммония нитрата (NH₄NО₃) готовят так же, как и предыдущий раствор. На 1 л воды расходуют 1500 г гранулированного порошка аммониевой селитры. Плот­ность раствора нитрата аммония должна быть 1,5.

Раствор натрия нитрата (NaNO₃) готовят путем добавления на 1 л воды 1 кг азотнокислого натрия. Плотность раствора равна 1,38-1,40.

Раствор цинка сульфата (ZnSO₄∙7H₂O) приготавливают при добавлении на 1 л воды 400 г сернокис­лого цинка. Его плотность равна 1,24.

Раствор натрия тиосульфата (Nа₂S₂О₃∙5Н₂О) с плотностью 1,4 готовят путем добавления к 1 л воды 1750 г вещества.

Раствор магния сульфата (MgSO₄) с плотностью 1,26-1,28 готовят путем добавления 920 г соли yа 1 л воды.

Методы седиментации

Метод последовательных промываний применяют для ди­агностики трематодозов. Пробу фекалий (3-5 г) кладут в стаканчик или фарфоровую ступку, заливают небольшим ко­личеством воды и, размешивая стеклянной палочкой (в ступке пестиком), добавляют воду до 50-100 мл. Смесь фильтруют через ситечко или марлю (1 слой) и отстаивают 3-5 мин. Затем верхний слой сливают, а к осадку добавляют такое же количество воды и процедуру повторяют до тех пор, пока надосадочный слой не будет прозрачным. Верхний слой слива­ют, а осадок порциями разливают в чашки Петри или на пред­метное стекло и микроскопируют.

Модификация метода по Т.Г. Никулину. Учитывая, что при последовательном сливании надосадочной жидкости про­исходит взмучивание, осадок и часть яиц трематод могут быть слиты. Т.Г. Никулин предложил отсасывать надосадочную жидкость грушей. При массовых исследованиях на наконеч­ник груши надевают кружок из картона (ограничитель). По­скольку во всех пробах в стаканчиках остается одинаковое количество осадка и он не взмучивается, результаты исследо­ваний являются более достоверными.

Метод седиментации с целлофановыми пленками по Г.А. Котельникову и В.М. Хренову предложен для диагно­стики фасциолеза и дикроцелиоза жвачных, аскариоза и трихоцефалеза свиней. Из гидрофильного целлофана толщиной 22 мкм нарезают прямоугольные кусочки 2×3 см и помещают их на 24 ч в бактериологическую чашку с 50%-ным раство­ром молочной кислоты или глицерина на одни сутки.

После приготовления целлофановых пленок берут пробу фекалий массой 2 г и размешивают в стаканчике с небольшим количеством воды. Взвесь фильтруют через металлическое ситечко или марлю (1 слой) в чистый стакан емкостью 50 мл, отстаивают 15 мин, сливают надосадочную жидкость, а к осад­ку добавляют 35-40 мл водопроводной воды, опять отстаива­ют 5 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок переносят на предметное стекло и покрывают целлофановой пленкой. Через 8-10 мин проводят микроскопию препарата. Раствор молочной кислоты или глицерина просветляет препарат, а плен­ка предохраняет его от высыхания.

Флотационно-седиментационный метод Н.В. Демидо­ва применяют для диагностики фасциолеза. Пробу фекалий (от крупного рогатого скота – 5 г, от овец – 3 г) помещают в большой стакан, заливают доверху насыщенным раствором натрия хлорида и тщательно размешивают стеклянной палоч­кой до получения равномерной взвеси. Взвесь отстаивают 15-20 мин, затем чайной ложечкой или совочком удаляют всплывшие па поверхность грубые частицы. Жидкость отсасывают грушей (при массовом исследовании допускается сливание), оставляя 20-30 мл ее над осадком, к осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают палоч­кой. Взвесь фильтруют в большие стаканы, фильтрат отстаи­вают в течение 5 мин (для фильтрации используют марлю или металлическое ситечко с ячейками 0,25 мм), жидкость из стаканов отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка. Оса­док перемешивают в конических стаканчиках, большие стака­ны прополаскивают водой и выливают, смыв в маленькие, взвесь отстаивают в конических стаканчиках 3-5 мин, а жидкость отсасывают. Эту процедуру повторяют до просветления надосадочной жидкости, затем осадок переносят на предметное стек­ло и микроскопируют.

Методы флотации

Метод Фюллеборна. В стакане емкостью 200 мл разме­шивают 8-10 г свежих фекалий с 20-кратным объемом насы­щенного раствора натрия хлорида. После тщательного разме­шивания смесь фильтруют через металлическое или капроно­вое ситечко (можно через марлю) в другой чистый стакан емкостью 100 мл и оставляют на 45-60 мин. Затем проволоч­ной петлей с поверхности взвеси берут 3-6 капель и наносят на хорошо обезжиренное предметное стекло, покрывают по­кровным стеклом и микроскопируют.

Метод Дарлинга. Пробу свежих фекалий массой 5 г сме­шивают в стакане с водой в соотношении 1:10 и через ситечко или марлю процеживают в другой чистый стакан. Фильтрат отстаивают 5 мин, верхний слой жидкости сливают, не взмучи­вая осадка, а осадок с небольшим количеством оставшейся жидкости (10 мл) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 2 мин при скорости 1500 об/мин. Надоса­дочную жидкость сливают, а к осадку приливают жидкость Дарлиига (глицерин, смешанный в равных частях с насыщен­ным раствором хлорида натрия). Пробирку встряхивают или размешивают палочкой, чтобы осадок смешался с флотацион­ной жидкостью, повторно центрифугируют в течение 2 мин при скорости 1500 об/мин. При наличии в пробе фекалий яиц гельминтов они всплывают на поверхность жидкости в центрифужной пробирке. Гельминтологической петлей берут 3-4 капли с поверхности взвеси, наносят на предметное стек­ло и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича выполняют по такой же методике, как и Дарлинга, но в качестве флотационной жидкости используют насыщенные растворы натрия гипосульфита или магния сульфата . Поскольку плотность указанных растворов выше, чем плотность жидкости Дарлинга, метод Щербовича используют для диагностики гельминтозов, яйца возбудителей которых имеют больший удельный вес (метастронгилез сви­ней, трихоцефалез, макраканторинхоз и др.).

Метод Г.А. Котельникова и В.М. Хренова наиболее эффективен при диагностике нематодозов, эймериозов и других паразитозов животных. Он выполняется в двух вари­антах.

Суть первого варианта состоит в том, что пробу фекалий массой 3 г кладут в стаканчик, добавляют раствор аммиачной селитры и тщательно размешивают стеклянной палочкой. За­тем порциями доливают раствор соли до 50 мл. Полученную взвесь фильтруют через металлическое или капроновое си­течко в другой стаканчик и дают отстояться в течение 10 мин. При диагностике стронгилятозов достаточно, чтобы взвесь от­стоялась в течение 3-5 мин. После этого гельминтологичес­кой петлей с поверхности взвеси снимают 3-6 капель с раз­ных мест, переносят их на предметное стекло и микроскопируют.

Второй вариант – метод флотации с аммиачной селитрой и с центрифугированием – это модификация метода Дарлинга при использовании в качестве флотационной жидкости на­сыщенного раствора аммиачной селитры. Он оказывается очень эффективным при диагностике ряда цестодозов, аскаридатозов, стронгилятозов и других паразитов.

Гельминтоларвоскопия

Оборудование и средства. Термостат, центрифуга, мик­роскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологический стереоскопический (МБС), аппарат Бермана, чашки бактериологические, баночки Флоринского, часовые и предметные стекла, пипетки глазные, марля, вата, 0,1%-ный водный раствор метиленового синего, насыщенный раствор цинка сульфата, центрифужные пробирки, пинцеты, ножнички, топкая мягкая проволока, конические стаканчики, стеклянные палочки, ра­створ Люголя.

Метод Бермана. Пробы свежих фекалий (10 г) помещают завернутыми в марлю или на металлическую сетку в воронку аппарата Бермана. Предварительно резиновую труб­ку, присоединенную к воронке, закрывают зажимом и в ворон­ку заливают воду комнатной температуры (35-38°С). Фека­лии мелких жвачных оставляют в воронке на 4-6 ч, крупного рогатого скота и лошадей – на 10-12 ч. За это время личин­ки диктиокаулюсов выползают из пробы фекалий в воду и постепенно опускаются по трубке вниз к зажиму. По истече­нии указанного времени зажим открывают и жидкость из ниж­ней части трубки осторожно сливают в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом.

Метод Бермана-Орлова является модификацией метода Бермана. В аппарате Бермана на конец резиновой трубки за­жим не устанавливают, а плотно присоединяют пробирку. При помещении в воронку с теплой водой фекалий личинки гельминтов оседают на дно пробирки. По истечении необходимого срока (для мелкого рогатого скота – 4-6 ч, для крупного рогатого скота и лошадей – 10-12 ч) пробир­ку отсоединяют от резиновой трубки, жидкость аккуратно сли­вают или отсасывают пипеткой, а осадок помещают на пред­метное стекло или чашку Петри и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича. Пробу фе­калий (8-10 г) помещают на кусочек марли, концы которой закручивают тон­кой мягкой проволокой и подвешивают в стакан с водой температурой 35-38°С. Пробы фекалий мелких живот­ных и лошадей выдерживают в течение 3 ч, крупного рогатого скота – 12 ч. Затем пробу фекалий из стакана извлекают, воду осторожно (не взбол­тать) сливают, осадок помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1 мин со скоростью 1000 об/мин. Надосадочную жидкость в пробирке сливают, осадок перено­сят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Вайда. На предметное или часовое стекло кладут несколько шариков свежевыделенных фекалий овец или коз и добавляют небольшое количество воды температурой около 40°С. Если шарики помещают на предметное стекло, достаточно нескольких капель воды. Через 40 мин шарики удаля­ют, оставшуюся жидкость на стекле исследуют под микроско­пом па наличие личинок. Методика эффективна при условии, если фекалии плотные. Применяют для диагностики диктиокаулеза, мюллериоза, протостронгилеза, цистокаулеза овец и коз.

Флотация с раствором цинка сульфата – избиратель­ный экспресс-метод диагностики диктиокаулеза по Котельникову и Хренову. Пробы фекалий (по 5 г) овец и коз кладут в стаканчик с раствором цинка сульфата , в течение 1-2 мин энергично разгоняют по кругу, не растирая и не размешивая. Не менее чем через 5-10 мин пробы вынимают пинцетом, взвесь оставляют на 10-15 мин. Затем металлической пет­лей снимают 6 капель с поверхности жидкости, переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Пробы от овец полужидкой консистенции и пробы от телят (5 г) также помещают в стаканчики с раствором цинка сульфата и выдерживают 20-30 мин без разгонки и размешива­ния. Затем фекалии удаляют, через несколько минут снимают металлической петлей 6 капель с поверхности пленки и мик­роскопируют. Личинки диктиокаулюсов в поверхностной плен­ке сохраняют подвижность до 3 ч. Метод обладает избира­тельностью в отношении личинок диктиокаулюсов. Личинки стронгилят пищеварительного тракта и стронгилоидов дефор­мируются и разрушаются в течение 1-2 мин, личинки мюллериусов свертываются спирально и напоминают пузырьки воз­духа.

Культивирование личинок гельминтов

Культивирование личинок гельминтов заключается в со­здании для их яиц таких условий, при которых они могли бы развиться до формирования инвазионных стадий личинок. По особенностям структуры инвазионных личинок определяют родовую, а иногда и видовую их принадлежность.

Культивирование стронгилят жвачных по методу А.М. Петрова и В.Г. Гагарина состоит в том, что в бактериологические чашки или в стаканчики кладут по 10 г свежих фекалий животных, увлажняют и помещают в термостат при температуре 27-30°С на 7-10 дней. Ежеднев­но фекалии перемешивают (с целью аэрации) и при необхо­димости увлажняют. После указанного срока пробы фекалий помещают в аппарат Бермана и из них выделяют личинок стронгилят. Помещают личинок на предметное стекло и микроскопируют с целью дифференциальной диагностики.

Для лучшей аэрации фекалий разработана методика культивирования личинок стронгилят в фекалиях с добавле­нием в них прокаленных древесных опилок. Соотношение фе­калий к опилкам составляет 3:1-5:1. Остальной режим куль­тивирования личинок стронгилят сохраняется таким же, как описано выше. Определение личинок до рода проводится по П.А.Полякову.

Культивирование личинок стронгилят лошадей по П.А. Величкину. В стакан емкостью 100 мл помещают 50 г свежих фекалий лошадей и ставят их в термостат при темпе­ратуре 25-27°С. Стаканы сверху обвязывают чистым бинтом, марлей или плотной бумагой, в которой делают небольшое от­верстие для аэрации. Срок культивирования личинок 6-7 дней. При культивировании личинок при комнатной темпера­туре (20-22°С) они достигают третьей стадии через 9-10 дней. При температуре ниже 8°С развитие их не происходит. При необходимости фекалии увлажняют и периодически пе­ремешивают.

Для выделения личинок стронгилят лошадей П.А. Величкин рекомендует после окончания срока культивирования пробу фекалий завернуть в марлю и поместить в стакан емко­стью 200 мл с теплой (35-36°С) водой. Для предупреждения соприкосновения пробы фекалий с дном стакана в него поме­щают предметное стекло или металлическую сетку. Спустя 2-3 ч пробу удаляют, верхний слой жидкости сливают, а оса­док помещают в бактериологические чашки и микроскопируют. Для лучшей дифференциации личинок их необходимо обездвижить, для чего к осадку в чашку добавляют 8-10 ка­пель раствора Люголя. Личинки стронгилят лошадей покры­ты гофрированным чехлом, имеют длинный хвостовой конец. Личинки свободноживущих нематод гофрированного чехлика лишены и у них короткие хвостовые концы. Родовую при­надлежность стронгилят лошадей определяют по внутренней структуре личинок. Определение родов и видов личинок стронгилят лошадей проводят по А.М.Петрову и В.Н.Гагарину.

Культивирование личинок стронгилоидесов по Т.И. Попо­вой проводят в обычных стеклянных стаканчиках, в которые помещают 50-100 г фекалий и выдерживают в течение 1-2 дней при температуре 20-23°С. Вышедшие из яиц личинки стронгилоидесов мигрируют на стенку стакана, образуя серо-белые скоп­ления, которые могут сохраняться до 1 мес. Личинки стронги­лоидесов из этих колоний можно использовать для эксперимен­тального заражения животных.

Посмертная диагностика гельминтозов

Полное гельминтологическое вскрытие животных по К.И. Скрябину проводят в тех случаях, когда необходимо иметь полную картину заражения гельминтами всех органов и тканей животных. Для этого перед вскрытием трупа тща­тельно осматривают его кожные покровы и слизистые оболоч­ки на наличие гельминтов. По правилам обычной секционной техники от трупа отделяют все органы, не нарушая их связи друг с другом. Всю кровь из серозных полостей собирают в кюветы для последующего промывания и исследования. Се­розные покровы полостей тщательно осматривают. Затем из­влекают спинной и головной мозг, вскрывают конъюнктивальные мешки, синовиальные и носовые полости, лобные пазухи и исследуют их содержимое. Извлеченные органы помещают в отдельную посуду (ведра, кастрюли, кюветы). Изучение их ведется мокрым или сухим способом.

При мокром способе проводят многократное промывание водой или изотоническим раствором натрия хлорида содер­жимого полостей различных органов с целью выделения гель­минтов; исследование содержимого различных отделов желу­дочно-кишечного тракта методом последовательных промы­ваний и просмотр отмытого материала (матриксов) поочеред­но на белом и черном фоне; компрессионное исследование слизистых оболочек всех органов; размозжение тканей раз­личных органов между стеклянными пластинками; размозже­ние тканей отдельных органов с последующим последователь­ным промыванием их и изучением отмытого матрикса с помо­щью лупы.

Сухой способ – это раздавливание органов между стек­лами до прозрачности и просмотр их под лупой без вскрытия и промывания. Его используют при изучении мелких живот­ных (моллюсков, членистоногих и др.).

Полное гельминтологическое вскрытие очень трудоемко, требует значительных затрат времени и поэтому применяется главным образом при научных исследованиях.

Неполное гельминтологическое вскрытие часто прово­дят при патологоанатомическом вскрытии трупов животных. При этом из органов и тканей трупа извлекают заметных не­вооруженным глазом гельминтов или крупные личинки, опре­деляют и подсчитывают их количество. При паразитировании мелких гельминтов или личинок этот метод малоэффективен. Интенсивность поражения крупными гельминтами неполным гельминтологическим вскрытием учитывают лишь приблизительно, отмечая слабое поражение (+), среднее (++) и силь­ное (+++).

Метод порционных гельминтологических вскрытий. Вви­ду громоздкости метода полных гельминтологических вскры­тий Р.С. Шульцем предложено матриксы из органов исследо­вать не полностью, а лишь одну четвертую их часть. Можно брать одну пятую, одну десятую часть и т.д. Для этого приго­товленный обычным способом матрикс помещают в измери­тельный цилиндр, тщательно взбалтывают и соответствующую часть отливают в другую посуду. Эту часть исследуют обыч­ными способами, т.е. матрикс просматривают на черном и белом фоне, а также под лупой. Всех обнаруженных парази­тов извлекают, подсчитывают, их количество умножают на число частей матрикса (на 4, 5, 10 и т. д.).

Особенности гельминтологического вскрытия птиц. У птиц ощипывают перья и тщательно исследуют поверхность кожи. После снятия кожи и осмотра подкожной клетчатки труп кладут на спину так, чтобы видны были все внутреннос­ти, и исследуют отдельные органы. Способом соскоба иссле­дуют слизистую фабрициевой сумки, зоба, железистого желуд­ка, яйцевода. Мышечный желудок вскрывают ножницами вдоль одной из его боковых суженных сторон. Двумя пальцами ле­вой руки захватывают край разрезанной кутикулы и медленно отделяют ее от собственно слизистой оболочки. Внимательно осматривают обнаженную слизистую оболочку и внутреннюю поверхность отделенной кутикулы. Почки исследуют комп­рессионным методом.

Консервирование гельминтов

Гельминтов, собранных для длительного хранения, необ­ходимо консервировать.

Трематод и цестод вначале кладут в проточную воду и держат до их гибели. Затем их осторожно прессуют в 70%-ном спирте 30-40 мин в бактериологической чашке между предметными стеклами. Хранят трематод и цестод в 70%-ном этиловом спирте.

Нематод обычно промывают в воде. Филярий и легочных нематод промывают только в изотоническом растворе натрия хлори­да. Хранят нематод в жидкости Барбагалло (3%-ный раствор формалина в изотоническом растворе хлорида на­трия).

Акантоцефал (скребней), добытых при вскрытии, сначала помещают в воду, затем путем слабого прессования их пере­дних концов выдавливают хоботок, чтобы зафиксировать его в вытянутом положении. Фиксируют акантоцефал в 70%-ном этиловом спирте.

Ларвоцист цестод (цистицерков, ценурусов, эхинококков, альвеококков) фиксируют жидкостью Барбагалло. Органы, пораженные гельминтами, фиксируют в 10%-ном растворе формалина.

Во всех случаях количество фиксирующей жидкости дол­жно в 20 раз превышать объем фиксируемого материала.

Хранение и пересылка гельминтологического материала

Законсервированный и этикетированный материал хранят в плотно закупоренной посуде. Пробирки с гельминтами по­мещают в большую банку с притертой пробкой, наполненную консервирующей жидкостью. Пробирки можно ставить в не­сколько ярусов, перекладывая их слоем ваты. В таком виде гельминты сохраняются длительное время.

Пересылать гельминтологический материал можно в про­бирках или банках, хорошо упакованных в деревянные ящи­ки. Патологоанатомические препараты, фиксированные в 10%-ном растворе формалина, можно пересылать без жидкости. Орган, извлеченный из фиксирующей жидкости, заворачивают во влажную вату или марлю, помещают в целлофановый па­кет, а затем упаковывают в плотный ящик.

Методы выявления и исследования простейших

Пироплазмиды

Для выявления пироплазмид исследуют мазки крови от животных, больных или подозреваемых в заболевании. В слу­чае гибели или вынужденного убоя больных животных мазки можно готовить из содержимого сосудов мозга, селезенки, пе­чени, почек, легких и пораженных лимфатических узлов. Маз­ки готовят только из органов свежих трупов, так как в них паразиты быстро лизируются, особенно при высокой темпера­туре окружающей среды. В необходимых случаях принимают меры для исключения инфекционных болезней.

Используют хорошо обезжиренные стекла. Кровь для ис­следования лучше всего брать из периферических сосудов ушной раковины. Место взятия подготавливают путем выстригания волосяного покрова, затем проводят дезинфек­цию и обезжиривание этиловым спиртом, спиртом-эфи­ром. Инъекцию проводят иглой или подрезают ножницами кончик уха.

Каплю крови в диаметре не более 2-3 мм, выступающую на месте прокола, наносят на край обезжиренного предметно­го стекла и делают мазок. Очень важно мазок подготовить с первой капли крови, т.к. в ней значительно больше поражен­ных пироплазмидами эритроцитов. Следующий мазок необ­ходимо готовить из свежей капли крови после удаления сгус­тка с места инъекции.

Изготовление мазков необходимо проводить в период повышения температуры тела животных и появления первых клинических признаков, до введения специфических препара­тов. Мазки просушивают на воздухе 10-20 мин, избегая воз­действия прямых солнечных лучей и ограничивая доступ мух. Затем их подписывают иглой или простым карандашом, ука­зывая вид и номер животного, дату и место взятия.

Для фиксации используют метиловый спирт, которым за­ливают мазки крови на 3-5 мин, после этого стекла вынима­ют и высушивают 15-20 мин.

Можно фиксировать смесью равных частей абсолютного этилового спирта и эфира или только этиловым спиртом 15-20 мин.

Хорошо подготовленный мазок должен быть равномерным и тонким. В толстых мазках эритроциты и находящиеся в них паразиты обнаруживаются с большим трудом.

Окраску можно производить по Романовскому-Гимзе. Для приготовления рабочего раствора краски на 1 мл дистиллированной воды добавляют 1-3 капли основного раствора краски. Рабочий раствор лучше всего подслаивать под стекло с мазком. В этих случаях на мазке не остается микрочастиц нерастворившейся краски, что облегчает при мик­роскопии поиск кольцевидных форм пироплазмид и диффе­ренциальную диагностику. Длительность прокрашивания маз­ков составляет 30-40 мин. По истечении этого срока краску смывают, мазок промывают дистиллированной водой, высуши­вают и исследуют с использованием микроскопа. Качество окраски зависит от рН среды (оптимальной средой является 6,8-7,0). Правильно окрашенные мазки имеют розовый цвет с фиолетовым оттенком. Эритроциты окрашиваются в розо­вый цвет, протоплазма лимфоцитов – в синий, их ядра – в темно-фиолетовый, протоплазма паразитов – в голубой, ку­сочки хроматина – в темно-красный или красный цвет.

Исследуют мазки под микроскопом с иммерсионной сис­темой.

Диагностика эймериозов и изоспорозов

Для выявления наличия ооцист эймерий и изоспор из фекалий, содержимого кишечника и другого материала исполь­зуется несколько методов.

Метод нативного мазка наиболее простой и легко выпол­нимый в любых условиях, не требующий специальной аппара­туры и реактивов для обнаружения ооцист.

На чистое предметное стекло пипеткой наносят 2-4 кап­ли чистой воды (дистиллированной, водопроводной), к ним добавляют небольшое количество фекалий и перемешивают. Мазок накрывают покровным стеклом и исследуют под малым (х 8,10) и средним (х 40) объективом . Вместо фекалий можно исследовать таким же образом соскобы оболочек кишечника.

При небольшой степени заражения ооцист выявить таким методом трудно, однако при высоком заражении он дает возможность сравнительно достоверно определить интенсив­ность инвазии.

Более точные результаты получают при использовании различных растворов, имеющих большой удельный вес. В та­ких растворах ооцисты через некоторое время всплывают на поверхность.

Наиболее распространенными флотационными методами являются следующие: методы Фюллеборна, Дарлинга, Щербовича, Котельникова и Хренова и др. (см. Гельминтоовоскопия).

Исследование эймериид в пораженных органах. Для ис­следования на наличие эймериид у животных отбирают ку­сочки тонкого и толстого кишечника, у кроликов, кроме того, печень, у гусей также почки. Материал помещают в фиксиру­ющую жидкость – 10%-ный раствор формалина или 96%-ный этиловый спирт. Лучше всего использовать нейтральный формалин, для приготовления которого используют порошок углекислого кальция (мел), 10% его добавляют к объему фор­малина и дают отстояться 5-6 дней, затем хранят с осадком.

Фиксацию материала лучше производить в стеклянной посу­де. В зимнее время в качестве фиксирующей жидкости лучше использовать этиловый спирт. Ее, независимо от времени года, рекомендуется через сутки заменять. Если в одну банку поме­щают кусочки органов от разных животных, их рекомендует­ся завернуть в марлевые мешочки. Внутрь банки с фиксиру­ющим материалом помещают бумажную этикетку, на которой графитным карандашом указывают вид животного, его номер и дату взятия материала.

Приготовленные гистологические срезы лучше всего окра­шивать гематоксилин-эозином.

При необходимости сохранения ооцист эймериид на дли­тельное время используют 5%-ный раствор формалина, 0,1%-ный раствор калия двухромовокислого, жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина на изотоническом растворе натрия хло­рида).

Токсоплазмы

Для выделения токсоплазм используют органы павших животных: головной мозг, лимфатические узлы, печень, селезенку, легкие, плаценту и органы абортированного плода. Вначале готовят мазки-отпечатки из пораженных органов, которые фиксируют метиловым спир­том (этиловым) и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Отбор органов и приготовление мазков производят не позже 2-3 часов после убоя или падежа животных. Указанным способом выделить токсоплазм удается не всегда.

Более эффективным способом является постановка биопробы на белых мышах.

Для этого отобранный материал из внутренних органов растира­ют с небольшим количеством изотонического раствора натрия хлорида и полученную суспензию вводят 3-5 белым мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл. В положительных случаях на 5-7 день развивается болезнь, при которой в брюшной полости накапливается экссудат, содержащий большое количество токсоплазм. При отрицательной биопробе, а также для накопления токсоплазм можно проводить 3-5 «слепых пассажей» путем введения суспензии головного мозга мышам от зараженных ранее белых мышей новой партии мышам.

Методическими указаниями по лабораторным исследованиям на токсоплазмоз животных, утвержденными 21.01.84, рекомендуется для обогащения материала цистами применять метод искусственного пере­варивания в желудочном соке. Патматериал (лимфоузлы, продолговатый мозг абортированного плода) измельчают, 50 г фарша помещают в колбу емкостью 1 литр и заливают 10 объемами искусственного желудочного сока. Колбу помещают в термостат при температуре 37°С на 1,5 часа. Полученную массу фильтруют через марлю, затем фильтрат центрифуги­руют при 2 тыс. об./мин. в течение 15 минут. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспензируют в двойном объеме изото­нического раствора с добавлением антибиотиков (пенициллин, стрептомицин по 1 тыс. ЕД на 1 л суспензии). Суспензию в дозе 0,3 мл вводят внутрибрюшинно 3-5 белым мышам.

Для обнаружения токсоплазм готовят мазки из содержимого брюшной полости или мазки-отпечатки из головного мозга, фиксируют, затем окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Наличие возбудителя в организме животных может быть подтвер­ждено путем использования РСК (РДСК), которую ставят в соответствии с «Временным наставлением по применению токсоплазмозного антигена Каз.НИВИ и института зоологии АН Каз.ССР в реакции связывания комплемента РСК (РДСК) для серологической диагностики токсоплазмоза и токсоплазмоносительства у животных».

Саркоцисты

Для обнаружения саркоцист исследуют у овец шейную часть пищевода, скелетные мышцы. Находят макроцисты величиной с прося­ное зерно и больше.

У свиней их можно обнаружить в мышцах диафрагмы, межреберных и др. Саркоцисты освобождают от окружающей ткани, на предметном стекле разрушают в 2-3 каплях изотонического раствора нат­рия хлорида, затем каплю суспензии микроскопируют при среднем увеличении микроскопа с опущенным конденсором. В положительных случаях обнаруживают банановидные (серповидные) мерозоиты.

Обнаружение микроцист производят путем исследования срезов величиной с овсяное зерно с мышц пищевода, диафрагмы, сердца, скелета. Срезы исследуют в раздавленном в компрессории виде под малым уве­личением микроскопа. Их можно окрашивать по Романовскому-Гимзе, генцианвиолетом, метиленовой синью и др.

Саркоцист можно также обнаружить и при гистологическом исс­ледовании пораженных тканей. Отобранные кусочки ткани фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина. Гистосрезы готовят обще­принятыми методами, а окрашивают гематоксилин-эозином.

Трихомонады

Выделение трихомонад производят путем микроскопического и культурального исследования патологического материала (истечения и смывы из половых органов, околоплодная жидкость, соскобы с плаценты, содержимое сычуга абортированного плода, секрет придаточных половых желез, спермы).

Для обнаружения подвижных трихомонад наносят на предметное стекло патологический материал в виде толстого мазка или делают раздавленную каплю и микроскопируют вначале под малым, затем сред­ним увеличением микроскопа при затененном поле зрения микроскопа. Мазок можно окрашивать по Романовскому-Гимзе с предварительной фиксацией в метиловом спирте.

Посевы исследуемого материала производят на специальные пита­тельные среды (среда Петровского) в количестве 0,3-0,5 мл из осад­ка пробы. Материал помещают в термостат при 37⁰С и исследуют на 3, 5, 7 и 10 день. Уже через 24-46 часов может наблюдаться рост трихомонад.

Вышеуказанные методы используются для выделения трихомонад при поражении половых органов у крупного рогатого скота.

У свиней, птиц трихомонады обитают в кишечнике и некоторых других органах. Для выделения паразитов используют соскобы с пораженных органов и исследуют нативным мазком.

Имеются данные о том, что и эти трихомонады хорошо растут на искусственных питательных средах.

Балантидии

Выделение балантидий производят путем исследования свежевыделенных фекалий или взятых из прямой кишки животного. Материал необходимо подвергнуть исследованию не позднее 2-3 часов после его взятия. Трупы свиней на наличие балантидий исследуют в течение 5-6 часов после смерти животного. В более поздние сроки баланти­дий обнаружить не удается в связи с их лизисом. По некоторым дан­ным (А.И.Федоров, 1980) трупы следует подвергать исследованию на обнаружение балантидий в течение 1,5-2 часов после убоя или гибе­ли поросят.

Микроскопическое исследование фекалий лучше всего провести не­посредственно на ферме, используя метод нативного мазка. Для этого берут небольшое количество фекалий, помещают на предметное стекло и равномерно перемешивают с равным количеством теплого изотоничес­кого раствора натрия хлорида или дистиллированной воды (темпера­тура не более 37,0°С), накрывают покровным стеклом и просматрива­ют мазок под малым увеличением микроскопа. В положительных случа­ях обнаруживают вегетативные формы и цисты балантидий. Под микро­скопом отчетливо видны крупные, быстро передвигающиеся при помощи ресничек паразиты.

При необходимости гистологического исследования отбирают кусочки стенок толстого и тонкого кишечника, желудка, лимфоузлов, паренхиматозных органов и фиксируют в 10% растворе формалина. Гистосрезы окрашивают гематоксилин-эозином.

Обследование животных с целью обнаружения паразитических клещей

Для обнаружения чесоточных клещей делают соскобы кожи. С этой целью путем осмотра на животном находят свежие чесоточные поражения и на границе здоровой и больной ткани брюшистым скальпелем соскабливают (до крови) верхний слой кожи. Если там нет выраженных очагов поражения, соскобы делают со складок или уплотненной кожи, где могут находиться чесоточные клещи.

У крупного рогатого скота, свиней, лошадей, овец соскобы делают более глубокие. У птиц их делают под роговыми чешуйками передней поверхности конечностей, с кожи и перьев. С этой целью роговые чешуйки выщипывают.

Если предполагается немедленное исследование, соскобы помещают в чашку Петри, если позже – их хранят в пробирке, которую обязательно плотно закрывают резиновыми пробками.

Исследование неподвижных чесоточных клещей. Соскобы кожи помещают в чашку Петри, стеклянный стаканчик или в пробирку и заливают 10 частями 10%-ного раствора натрия или калия гидроокиси и подогревают в течение 10-15 минут до температуры 80-90⁰С. После этого соскобы небольшими порциями переносят на предметное стекло, материал тщательно расщепляют препаровальными иглами, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Метод Г.З. Шика. Соскоб в количестве 1 г помещают в центрифужную пробирку, заливают 1- мл 10%-ного раствора калия гидроокиси, помешивая подогревают до температуры 50-60⁰С в течение 20 мин, а затем центрифугируют. Жидкость из пробирки сливают, а осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Н.Н.Богданова. Соскобы с кожи помещают на черную бумагу, подогревают до 28-30⁰С. Под действием тепла паразиты выползают из соскобов, их собирают с помощью препаровальной иглы, помещают на предметное стекло и исследуют с помощью микроскопа.

Метод А.В. Алфимовой. Соскобы кожи помещают в чашку Петри и ставят в термостат при температуре 37-40⁰С. Через 5 минут чашку Петри из термостата вынимают и влажной кисточкой со дна собирают двигающихся клещей, помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Исследование клещей демодекс. Осматривают и пальпируют кожу больного животного. При обнаружении бугорков (величиной до горошины и более) шерсть над ним выстригают и поверхность обрабатывают этиловым спиртом. Бугорок прокалывают стерильной иглой для взятия крови. Содержимое из иглы извлекают мандреном, помещают на предметное стекло, добавляют несколько капель воды или глицерина, препарат покрывают стеклом и микроскопируют.

Сбор и консервирование насекомых

С целью определения видового состава, численного соотношения и изучения биологических особенностей насекомых осуществляют сбор или отлов их на теле или вне тела животного.

Способы сборы насекомых на теле животных. Наиболее эффективным способом отлова насекомых на животных является сбор их с тела в дни и часы интенсивного нападения или при постоянном обитании эктопаразитов. Однако этот способ не позволяет полностью выявить видовой состав тех или иных групп и видов насекомых и практически абсолютно исключает сбор самцов комаров, мошек, мокрецов и других, которые на животных не нападают, так как питаются растительными соками. Поэтому отлов насекомых необходимо проводить в помещениях или местах их наибольшего скопления. Для отлова насекомых используют в основном энтомологический сачок. Спокойно сидящих крупных двукрылых насекомых берут непосредственно пальцами рук, стараясь не травмировать насекомое, или пинцетом.

Для отлова мелких насекомых, мокрецов, комаров, мошек, москитов можно применять пробирки или всасывающие устройства – эксгаустеры.

Власоедов, пухопероедов, вшей, блох собирают на теле хозяина с учетом их локализации. До начала сбора тело животного увлажняют одним из инсектицидов, а затем при помощи жесткой кисточки или плотным гребешком, пинцетом вычесывают насекомых в воронку, закрепленную в пробирке, или на бумагу.

Личинок оводов, куколок кровососок собирают, учитывая их локализацию в тканях, органах, полостях тела хозяина.

Сбор насекомых вне тела хозяина. Отлов слепней, оводов, мух производят энтомологическим сачком около животных, на приманочных заборах, на шкурах или возле трупов павших животных. Мух-коровниц отлавливают над коровяками, на пастбище, а домашних мух – в помещениях для скота, молочных блоках. Возможно применение различных мухоловок, а для гематофагов использую чучелообразную ловушку К.В.Скуфьина.

Для получения взрослых оводов их выращивают из зрелых личинок в садках или стеклянных банках на слое сухого песка при температуре 18-25^оС. После окукливания через 20-30 дней вылупляются имаго оводов.

Консервирование насекомых в жидкостях. При сборе насекомых используются консервирующие жидкости, в которых хранят власоедов, блох, мокрецов, мошек, москитов, личинок или отсеченные головы и другие фрагменты мух для приготовления постоянных препаратов. Используется 70^о-ный этиловый спирт, 5%-ный водный раствор формалина или 3%-ный раствор формалина на 0,85%-ном изотоническом растворе натрия хлорида (жидкость Барбагалло). Объем жидкости должен в 10-20 раз превышать объемное количество насекомых, и ее необходимо сменить через сутки после погружения материала.