По механизму действия ферменты делят на 6 групп:
1. Оксидоредуктазы. Они катализируют окислительно-восстановительные реакции переноса атомов водорода и кислорода от одного вещества к другому (каталаза, дегидрогеназа, оксидаза и др.).
2. Трнсферазы. Катализируют перенос различных групп атомов (ацильной, метильной, фосфатной или аминогрупп) от вещества к веществу (протеинкеназа, пируваткеназы и др.).
3. Гидролазы. Катализируют реакции гидролиза, протекающие с расщеплением внутримолекулярных связей и присоединением воды в точке расщепления (амилаза, липаза, пептидаза и др.).
4. Лиазы. Катализируют реакции отщепление и присоединение групп атомов с образованием двойной связи (фумараза, альдолаза, аспартаза).
5. Изомеразы. Катализируют реакции внутримолекулярной перестройки (изомераза, глюкозоимераза и др.).
6. Лигазы. Катализируют соединение молекул с образованием новых связей с использованием связей молекул АТФ (ДНК-лигаза, синтетаза).
Ферменты синтезируются, как все белки, на рибосомах и накапливаются в цитоплазме и др. структурах, находятся на поверхности клетки, или выделяются в окружающую среду.
Принцип действия ферментов
Механизм действия ферментов состоит в снижении энергии активации, необходимой молекуле субстрата, чтобы вступить в реакцию. Согласно существующим теориям (промежуточных соединений, адсорбционной, цепных реакций) снижение энергии активации происходит в результате адсорбции реагирующих веществ на поверхности фермента с образованием промежуточного нестойкого соединения – фермент-субстратного комплекса, что приводит реагирующие вещества в напряженное состояние и способствует быстрому протеканию реакции. Фермент является начальным, или «запальным» фактором, в дальнейшем катализируемая им реакция протекает самостоятельно. Поэтому основная роль биокатализатора состоит в преодолении молекулами субстратов активационного барьера на более низком энергетическом уровне (рис. 9).
Рис. 9. Характеристика энергетического состояния катализируемой (1) и некатализируемой (2) реакции
Кроме того, в активном центре сосредоточено много неполярных групп, и эта область действует как органический растворитель. Здесь же находится небольшое число заряженных полярных боковых групп аминокислот, реакционная способность которых выше в органическом растворителе, чем в водной среде. Имея большую гибкую молекулу, ферменты способны сосредоточить на небольшом участке необходимые группы для осуществления конкретной реакции с субстратом.
У сложных ферментов, имеющих кофакторы, возможности взаимодействия с субстратом значительно увеличиваются. Соединение фермента с субстратом в каталитическом центре может происходить с помощью ковалентных связей, при участии электронов, с помощью водородных связей или более слабых взаимодействий, например сил Ван-дер-Ваальса. Причем фермент и субстрат в районе активного каталитического центра должны сблизиться до расстояния 1,5-2 нм. В этих условиях внутренние связи в молекуле субстрата ослабляются, и создается возможность для реакции с ферментом.
В водном растворе вещества реагируют только при столкновении. Если бы не было ферментов, эти столкновения были бы крайне редки. Как известно, ферменты обладают очень высокой каталитической активностью. Одна молекула фермента за 1 мин может прореагировать с тысячами и даже миллионами молекул специфического субстрата. Так, алкогольдегидрогеназа, катализирующая превращение ацетальдегида в этиловый спирт, превращает в 1 мин 4700 молекул субстрата, а фосфотриозоизомераза -500 тыс. молекул.
Для действия каждого фермента характерна оптимальная температура, при которой скорость реакции максимальна. Так, α-амилаза культуры Aspergillus oryzae имеет оптимум температуры 50-55°С. Оптимум температуры большинства используемых в биотехнологии ферментов микроорганизмов 30-40 °С. Оптимум действия одних ферментов, например пепсина, наблюдается в кислой среде (рН 2,0), других – в щелочной, а у большинства ферментов – в нейтральной.
Активаторами многих ферментов являются цистеин и глутатион. Эти вещества восстанавливают дисульфидную связь, образуя SH-группы, которые входят в состав каталитических центров и часто определяют ферментативную активность. Ингибиторы ферментов могут быть неспецифическими (например, соли тяжелых металлов, которые при связывании с белками осаждают их из растворов) или специфическими (например, синильная кислота, которая реагирует с определенными химическими группами ферментов и ингибирует железосодержащих дыхательных ферментов).
Промышленное производство ферментов
Промышленным способом чаще всего получают ферменты группы гидролаз. Рассмотрим их производство на примере протеолитической группы.
Ферменты из растительного сырья. В промышленных условиях ферменты из растений получают в субтропических и тропических странах. Для этого используют такие растения, как папайя, ананас и инжир. Плоды папайи в стадии молочной зрелости содержат в соке значительное количество протеолитических ферментов. В этот период собирают сок плодов папайи. Для этого острым ножом сверху вниз слегка надсекают плоды, которые на деревьях образуют грозди. Плоды остаются на деревьях, а под гроздь подвешивают ведро, в которое стекает сок в течение суток или нескольких часов. Затем сок, который чаще называют латексом, тонким (1-1,5 см) слоем разливают в плоские емкости и ставят в теплое место, в солнечный день обычно в тени. Латекс быстро высыхает, образуя тонкие пластины, которые легко снимаются. Их можно измельчить для получения технического препарата – папаина, а можно сразу подвергнуть очистке всеми известными методами: осаждением органическими растворителями, высаливанием, концентрацией с помощью ультрафильтрации. Можно также использовать современные тонкие методы очистки, т. е. использовать общепринятые способы получения высокоочищенных препаратов вплоть до кристаллических и гомогенных ферментов.
Вторым по объему производства протеолитическим ферментом растительного происхождения является бромелаин (бромелин). Его получают из листьев, стеблей и оболочек плодов ананаса.
После уборки урожая всю зеленую массу, за исключением корневой части растения, измельчают и подвергают водной экстракции. Затем полученный экстракт обрабатывают в зависимости от дальнейшего применения.
Третьим известным препаратом растительной протеиназы является фермент фицин, который получают из листьев и молодых побегов инжирного дерева. Особенность получения препарата заключается в том, что сырье собирают вручную ранним утром на восходе солнца в деревянную тару. Затем материал давят в любых емкостях, приспособленных для сбора и хранения, исключая контакт с металлом, и экстрагируют водой. Экстракт концентрируют. Жидкий концентрат можно использовать для смягчения мяса непосредственно перед кулинарной обработкой, при производстве специальных колбас и копченых мясных изделий.
В умеренном климатическом поясе растительные амилолетические ферменты для пищевой промышленности получают из проросшего зерна – солода. Солод используют либо сырым в размолотом виде, либо в сухом виде. В промышленных масштабах очищенные ферментные препараты из солодов не производят.
Получение ферментных препаратов из животного сырья. В промышленных условиях при переработке мяса различных животных в самый первый момент разделки туши производят сбор ферментного сырья (поджелудочная железа, слюнные железы, слизистая оболочка желудков и тонкого кишечника, сычуги крупного рогатого скота и овец, семенники половозрелых животных).
Слизистая оболочка желудков свиней и крупного рогатого скота содержит пепсин и липазу, слюнные железы – амилазу, сычуг молодняка – сычужный фермент и т. д.
Свежеотобранные органы и ткани животных, содержащие ферменты, очень нестойки при хранении. Поэтому после сбора сырье следует немедленно переработать или законсервировать с помощью низких температур, обработки поваренной солью, ацетоном, этиловым спиртом или же высушиванием.
Для получения технических препаратов допускается консервирование животного сырья поваренной солью. Этот метод используется, например, при получении панкреатина.
Из заготовленного на мясокомбинатах животного сырья на специальных заводах органопрепаратов получают ферментные препараты различной степени очистки. Процесс получения их складывается из ряда последовательных операций: измельчение сырья, экстракция ферментов, высаливание, отделение белковых осадков от жидкой фазы, очистка, кристаллизация и сушка препаратов.
В зависимости от вида используемого сырья применяют различные методы измельчения и разрушения клеток. К ним относят: попеременное замораживание и оттаивание, автолиз, обработку дубильными веществами, органическими растворителями и др. Клеточные оболочки и ткани, содержащие большое количество влаги, можно разрушить механическим измельчением и прессованием.
В настоящее время используют механическое измельчение сырья на специальных мясорубках, волчках, куттерах и машинах, на которых можно получить тончайшие срезы с замороженного сырья (микротомы).
При измельчении животного сырья не обязательно стремиться к очень тонкому помолу, так как это может значительно затруднить дальнейшую переработку сырья. Тонкое измельчение может привести к образованию устойчивых суспензий за счет стабилизации их высокомолекулярных соединений, содержание которых в растворе резко возрастает по мере увеличения степени измельчения сырья.
Извлечение ферментов из измельченной животной ткани можно проводить тремя видами экстрагентов: водным раствором кислот при рН 1,0-2,0; водой или водными растворами солей при рН 7,0-8,0; концентрированным водным раствором органических растворителей (этанол, метанол, ацетон, глицерин).
Экстракцию проводят ступенчато, 2-3 раза заливая обрабатываемое сырье экстрагентом. Для лучшего извлечения ферментов всю массу в процессе экстракции перемешивают. После каждого настаивания обрабатываемого сырья экстрагент отделяют центрифугированием. Если выделяемый фермент очень нестабилен, то вместо центрифугирования используют фильтрацию под вакуумом.
Методы выделения и очистки ферментов и экстрактов животных тканей незначительно отличаются от получения ферментных препаратов из культур микроорганизмов. Их выделяют осаждением органическими растворителями (этанол, метанол, изопропанол, ацетон, хлороформ и др.), солями (сульфат аммония, натрия или магния, ацетат натрия, хлорид натрия). В дальнейшем для более полной очистки используют диализ, ультрафильтрацию, адсорбцию.
Ферменты микробиологического происхождения.
В связи с увеличивающимися потребностями в ферментных препаратах растительное и животное сырье не устраивает производителей. Содержание ферментов в растениях, как правило, низкое. Кроме того, получение ферментов из растений носит сезонный характер. Органы животных также можно получить только на мясокомбинатах, при этом возникают проблемы с консервированием и хранением этого вида сырья.
Единственным неограниченным источником ферментов являются микроорганизмы, из которых можно выделить любые из известных в настоящее время ферментов, за исключением папаина.
Синтезируемые микроорганизмами ферменты подразделяют на внеклеточные и внутриклеточные. К внеклеточным относят амилазу, целюлазу, лактазу, липазу, пектиназу, протеазу, к внутриклеточным – аспарагиназу, каталазу, инвертазу.
Внеклеточные ферменты получают из культуральной жидкости, предварительно отделенной от микроорганизмов. Для выделения внутриклеточных ферментов разрушают клеточные оболочки физическими или химико-ферментативными методами (гидролиз, ферментолиз, автолиз и др.). Далее выделение ферментов внутриклеточного и внеклеточного происхождения идет по одинаковой схеме. Вначале ферменты выделяют методами экстракции, осаждения, адсорбции, ионного обмена, ультрафильтрации и др., а затем очищают при помощи хроматографии, диализа и кристаллизации (см. лекцию № 4). При необходимости ферменты концентрируют, обезвоживают, модифицируют и стабилизируют.
Современные методы генетики и генетической инженерии позволяют целенаправленно увеличивать выход необходимого фермента. Кроме того, среди микроорганизмов можно найти формы, живущие в экстремальных условиях (термофилы, галофилы и др.). Это означает, что из микроорганизмов можно выделить ферменты с улучшенными свойствами – термостабильные, осмоустойчивые, кислото- и щелочеустойчивые.
Иммобилизованные ферменты
В клетках ферменты обычно находятся не в растворенном состоянии, а локализованы в органеллах клеток. Это связано с тем, что ферменты являются нестабильными соединениями и при химическом воздействии могут быстро инактивироваться, они достаточно чувствительны к рН среды, температуре. Кроме того, свободные ферменты могут быть использованы лишь один раз, и цена их достаточно высока.
Поэтому актуальным является производство иммобилизированных (связанных) ферментов.
Идея создания «нерастворимых», или «связанных» ферментов, которые позднее стали называть иммобилизованными возникла еще в 1950-х годах. К ее реализации имел отношение бывший президент Израиля Э. Качальский-Катцир. Мы привыкли, что президентами становятся политики, хозяйственники, юристы. Но этот человек до своего избрания был ученым-биохимиком и после пребывания на президентском посту вернулся в науку и до своей смерти в 1995 г. возглавлял институт биотехнологии в Тель-Авиве.
Иммобилизация – это прикрепление фермента к нерастворимому носителю, причем таким образом, чтобы фермент мог обмениваться с раствором молекулами субстрата и продукта.
При этом появляется про
стая возможность отделять и многократно использовать такой иммобилизованный фермент. Кроме того, оказалось, что закрепленный фермент сохраняется в активном состоянии гораздо дольше, чем свободный, растворенный.
Методы иммобилизации ферментов
1. Адсорбция на носителе (рис. 10.А). Носителями могут быть неорганические материалы (стекло, силикагель, бентонит, оксид алюминия, диоксид титана и др.), природные полимеры (целлюлоза, коллаген) и синтетические полимеры (нейлон, полиэтилен, полипропилен).
2. Включение в гель агар-агара, альгинатов, карагинана (типа желе) (рис. 10.Б).
А Б
Рис. 10. Иммобилизация фермента методом адсорбции (А), методом включения в гель (Б): 1 – гранула носителя; 2 – молекула фермента.
Молекулы фермента сидят в порах геля. Гель проницаем для молекул субстрата и продуктов реакции за счет молекулярной диффузии.
3. Ковалентное связывание с носителем. Носителем в этом случае является полимерный материал, длинные молекулы которого в разных местах связаны химическими ковалентными связями с молекулами фермента (рис. 11.А).
4. Поперечная «сшивка» молекул фермента при помощи бифункциональных реагентов. Молекулы фермента, свободно перемещающиеся в растворе, соединяются между собой различными своими участками с помощью определенных реагентов (рис. 11.Б).
А Б
Рис. 11. Иммобилизация фермента методом ковалентного связывания с носителем (А); методом поперечной «сшивки» (Б).
Получается некое пространственное образование, включающее активные молекулы фермента и довольно большие пространства между ними, удобные для диффузии молекул субстрата и продукта реакции.
5. Адсорбция на носителе с последующей поперечной «сшивкой». Этот способ сочетает в себе способы 1 и 4.
По сравнению с обычной адсорбцией на носителе получается более глубокий слой молекул фермента, доступных для субстрата и продукта, а по сравнению с обычной «сшивкой» – более прочная гранула, имеющая жесткий остов в центре (рис. 12.А).
6. Включение в полупроницаемые капсулы. Внутри капсулы (рис. 12.Б) как бы существует коллоидный раствор фермента. Внешняя оболочка капсулы довольно прочная, непроницаема для фермента, но проницаема для продукта и субстрата.
А Б
Рис. 12. Иммобилизация фермента методом адсорбции на носителе с последующей поперечной «сшивкой» (А); методом включения в полупроницаемые капсулы: 1 – капсула с полупроницаемой стенкой; 2 – молекулы фермента, взвешенные в растворе внутри капсулы
7. Сополимеризация фермента и полимера-носителя. Напоминает включение в гель, но матрица создается путем сополимеризации полифункционального реагента и фермента (т.е. фермент не просто находится в «клетке» геля, но и сцеплен с ней). Этот способ является сочетанием способов 2 и 4 (рис. 13).
Примером является широко распространенный полиакриламидный гель, в котором в качестве реагента используется глутаровый альдегид.
Рис. 13. Иммобилизация фермента
методом сополимеризации с полимером-носителем
8. Физическое смешение – перемешивание фермента и порошка носителя. Метод довольно прост, но не очень надежен. Фермент может отслаиваться от носители и переходить в раствор.
Во всех случаях иммобилизации допускается прикрепление фермента только с помощью функциональных групп, не входящих в активный центр фермента. Один и тот же фермент может быть иммобилизирован несколькими методами. Однако иммобилизация всегда связана с потерей части активности фермента, кроме того, частично нарушается свободный доступ фермента при его связывании. Но, несмотря на потерю от 10 до 90 % активности фермента при его иммобилизации и на уменьшение скорости течения реакции такие ферменты имеют технологические преимущества по сравнению с несвязанными. Их можно легко отделить от продуктов реакции и использовать многократно и фермент не загрязняет продукт. Кроме того, иммобилизованные ферменты более стабильны к действию температуры и рН среды. Так ферменты, которые в свободной форме инактивируются при 50 ºС мгновенно, после иммобилизации работают неделями и месяцами.
Сферы использования ферментов
В современной промышленности наибольшее значение имеют гидролитические ферменты. Они способны катализировать реакции без присутствия коферментов. В многих химических процессах гидролазы заменили процесс кислотного гидролиза. С их помощью получают вещества без ущерба для вкуса и аромата продукта.
Кроме того, по внешнему проявлению действия различают несколько групп ферментов, большинство из которых входит в группу гидролаз:
К амилолитическим ферментам относятся α-амилаза, β-амилаза, глю-коамилаза. Их действие проявляется при гидролизе крахмала и гликогена. Крахмал при гидролизе сначала расщепляется на более простые полисахариды – декстрины, а затем – до глюкозы.
α-амилаза гидролизует любые а-1,4-глюкановые связи (амилаза, амило-пектин, гликоген); β-амилаза – фермент концевого действия, последовательно отщепляет остатки дисахарида мальтозы от концов цепей. Глюкоамилаза гидролизует крахмал с образованием глюкозы и небольшого количества декстринов. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.
Протеолитические ферменты относятся к гидролазам, образуя группу пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность – выборочный, селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин – только на связь между аргинином и лизином. Из них рН 1,5-3,7 имеют кислые протеазы; рН 6,5-7,5 – протеазы; рН> 8,0 – щелочные протеазы.
Применение протеаз широкое: мясная промышленность для умягчения мяса, кожевенная промышленность – при обезволошивании (удаление волосяного покрова) и мягчении шкур; кинопроизводство – для растворения желатинового слоя на пленках при их регенерации; парфюмерия – при создании добавок в зубную пасту, кремы, лосьоны, промышленность синтетических моющих средств – при применении моющих добавок для удаления загрязнений белковой природы; медицина – при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов.
Пектолитические ферменты объединены в одну группу по внешнему проявлению своего действия – уменьшению молекулярной массы и снижению вязкости пектиновых веществ (пектин – пектиновые кислоты и протопектин) представителей полисахаридов. Они содержатся во фруктах, корнеплодах, стеблях (лен). Пектиновые вещества имеют молекулярную массу от 20000 до 200000. Все пектиназы делятся на два вида – гидролазы и трансэлиминазы. Первые отщепляют метильные остатки (пектинэстеразы) или разрывают α-1.4-гликозидные связи (полигалактуроназы). Вторые ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применение в текстильной промышленности – вымачивание льна перед его переработкой, в виноделии – осветление вин, уничтожение мутности, в консервировании – при приготовлении фруктовых соков.
Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется лишь в деполимеризации молекул целлюлозы, обычно они действуют в виде комплекса, который в целом доводит гидролиз целлюлозы до глюкозы. Использование их очень перспективно в гидролизной промышленности – это получение глюкозы из целлюлозы; в медицинской – выделение лекарственных веществ (стероидов) из растений; в пищевой – улучшеие качества растительных масел; в сельском хозяйстве – как добавки в комбикорма для жвачных животных.
В мире производится около 530 т протеаз, 350 т глюкоамилазы, 350 т α-амилазы, 70 т глюкозоизомеразы.
3.2. Биотехнология молочных продуктов
Микробиология кисломолочных продуктов. Кисломолочные продукты (сметана, творог, простокваша, кефир, кумыс и др.) имеют высокую усвояемость, повышенную стойкость. Они имеют высокие вкусовые качества и обладают лечебными свойствами, быстрее, по сравнению с цельным молоком, подавляют развитие гнилостной микрофлоры. В 1 мл кисломолочного продукта содержится до 1-2 млрд. клеток микробов.
Кисломолочные продукты, приготовленные на заквасках мезофильных молочнокислых бактерий (простокваша обыкновенная, творог и сметана).
Для получения обыкновенной простокваши молоко, пастеризованное при 85-90°С в течение 10-15 мин. и охлажденное до 30°С, заквашивают 5% закваски, содержащей чистые культуры мезофильных молочнокислых стрептококков (Str.lactis, Str.cremoris) и ароматообразующие бактерии. При этих условиях молоко сквашивается через 6-8 ч.; после образования сгустка простоквашу (при кислотности не ниже 75°Т) направляют в помещение с температурой близкой к 0°С (но не выше 8°С) для набухания белков. Готовая простокваша имеет ровный сгусток и слабокислый вкус (кислотность 85-110°Т).
Для приготовления творога и сметаны применяют ту же закваску, что и для простокваши обыкновенной (т.е. смесь мезофильных молочнокислых стрептококков). Отличие в свойствах молочнокислых стрептококков заключается в том, что для приготовления сметаны, используют расы Str.lactis, образующие вязкую сметанообразную консистенцию, тогда как для приготовления простокваши и творога применяют расы, образующие при сквашивании молока ровный плотный сгусток. Для улучшения вкуса и аромата в закваску вводят ароматообразующие бактерии. Использование при выработке творога заквасок мезофильных и термофильных молочнокислых стрептококков (в соотношении 1:1) позволяет при повышенной температуре сквашивания (38-40°С) значительно сократить продолжительность технологического процесса.
Кефир приготовляют на естественной закваске – кефирных грибках, представляющих собой симбиоз различных микроорганизмов. Куда, кроме мезофильных молочнокислых палочек (бета бактерий и стрептобактерий) и дрожжей, входят молочнокислые стрептококки и уксуснокислые бактерии.
В процессе приготовления кефира происходит молочнокислое и спиртовое брожение: первое вызывается мезофильными молочнокислыми стрептококками и палочками, второе – дрожжами и в меньшей степени ароматообразующими бактериями.
Для приготовления кефира закваску вносят в сквашенное молоко в количестве 5% объема. Сквашивание кефира правильнее вести при пониженной температуре (20-22°С или ниже). Более высокая температура (28-30°С) приводит к вытеснению молочнокислыми стрептококками молочнокислых палочек и дрожжей.
Большое влияние на спиртовое брожение в кефире оказывает температура его созревания (лучше 10-12°С). При этой температуре дрожжи развиваются в достаточном количестве, а молочнокислое брожение резко замедляется.
В зависимости от длительности созревания различают слабый (однодневный), средний (двухдневный) и крепкий (трехдневный) кефир.
В слабом кефире кислотность 90°Т, содержание спирта 0,2%; в среднем – соответственно 105°Т и 0,4%; в крепком – 120°Т и 0,6%.
Для приготовления кефира на чистых культурах используют закваску: молочнокислые стрептококки (Str.lactis, Str.cremoris) и ароматобразующие бактерии, молочнокислые палочки (бета-бактерии и стрептобактерии), дрожжи, сбраживающие молочный сахар.
Кисломолочные продукты, приготовленные на заквасках термофильных молочнокислых бактерий.
Болгарская простокваша (йогурт) является кисломолочным продуктом, широко распространенным в Болгарии, Греции, Турции; близким к ней по способу приготовления являются южная простокваша, мацун (Армения), мацони (Грузия), даги (Индия).
Болгарскую простоквашу готовят из молока, пастеризованного при температуре 85-90°С. Если пастеризацию проводят с выдержкой, то получают продукт с более плотной консистенцией.
При заквашивании молока 5 % закваски, содержащей смесь термофильного стрептококка и болгарской палочки, свертывание наступает через 2,5-3 ч. (при температуре сквашивания 40-42°С). Готовая простокваша после охлаждения имеет плотный сгусток и сметанообразную консистенцию; вкус – чистый, кисловатый.
Положительным свойством болгарской простокваши является ее способность удерживать сыворотку даже при длительном хранении.
Приготовление простокваши с использованием термофильных молочнокислых бактерий, помимо улучшения вкуса продукта, значительно ускоряет процесс сквашивания (до 2,5-3 ч. вместо 5-6 ч. при сквашивании обычным методом).
Одной из разновидностей йогурта является биогурт, в состав закваски которого входит ацидофильная палочка и Str.lactis, выделенный из норвежского кислого молока тэтте.
Кисломолочный напиток «Снежок». Состав микрофлоры этого кисломолочного напитка сходен с микрофлорой болгарской простокваши. Для его приготовления в молоко вносят 7 % сахара; смесь пастеризуют при температуре 85-92°С, гомогенизируют под избыточным давлением 175 атм. и выдерживают 10 мин.
Далее смесь охлаждают (летом – до 42-45°С, зимой – до 50°С) и заквашивают 5 % закваски (4 % термофильного стрептококка и 1 % болгарской палочки). Сквашивание молока продолжается обычно не более 2,5-3 ч., кислотность готового продукта не должна превышать 80°Т. Сгусток размешивают и охлаждают до 8-10°С, добавляют фруктовый сироп. После этого напиток снова размешивают и разливают в бутылки.
Ацидофильная простокваша. Продукт очень близкий к болгарской простокваше и отличается тем, что в состав закваски вводят ацидофильную палочку вместо болгарской. Ацидофильная палочка обладает большой способностью приживаться в кишечнике, и ее применяют при изготовлении диетических кисломолочных продуктов.
Кумыс является диетическим кисломолочным напитком, приготовленным из молока кобылиц.
При сквашивании молока кобылиц казеин выпадает в виде мелких хлопьев, почти не ощутимых на языке и практически не меняющих консистенцию напитка. Как и кефир, кумыс является продуктом комбинированного брожения – молочнокислого и спиртового. Однако, если в кефире основным является молочнокислое брожение, то в кумысе оно играет второстепенную роль, а главную – спиртовое брожение.
Основную микрофлору кумыса составляют термофильные молочнокислые палочки, близкие к Lactobact. bulgaricum. Другим элементом микрофлоры кумыса являются дрожжи.
По кислотности и содержанию спирта кумыс разделяют на три вида: слабый с кислотностью 60-80 ºТ и содержание спирта до 1,0 %; средний с 81-105 ºТ и до 1,75 %, а также крепкий с 106-120 ºТ и до 2,5 % соответственно.
Биотехнология масла
Жизнедеятельность микроорганизмов протекает преимущественно в плазме масла, которая представляет собой водный раствор белков, молочного сахара, молочной кислоты (в кислосливочном масле), солей и других веществ.
Плазма находится в масле в виде капель различной величины, частично соединенных между собой тончайшими капиллярами. В 1 г масла содержится около 10-18 млн. капель влаги. При сбивании масла большая часть микроорганизмов переходит в пахту. В 1 мл сливок с 10 % закваски содержится 278 млн. бактерий, в 1 мл масла – 4,1 млн. и в 1 мл пахты – 336 млн. (Гримес).
Микроорганизмы в сладкосливочном масле играют чаще всего отрицательную роль (только некоторые виды дрожжей способствуют повышению стойкости масла при хранении). В кислосливочном масле роль молочнокислых бактерий положительная. Они способствуют созданию в нем специфического вкуса и аромата и повышают его стойкость (образовавшаяся молочная кислота подавляет гнилостные бактерии).
Сырьевой основой для производства масла являются молочные сливки. При выработке кисломолочного масла основную микрофлору сливок составляют молочнокислые стрептококки (Str. lactis, Str. cremoris) и ароматообразующие бактерии.
Изменение микрофлоры масла при его хранении
Сладкосливочное масло в зависимости от температуры хранения характеризуется следующим составом микрофлоры: при низкой положительной температуре в значительном количестве находятся посторонние (немолочнокислые) микроорганизмы (микрококки, споровые и бесспоровые палочки, дрожжи и др.); при повышенной температуре хранения преобладают молочнокислые бактерии.
Основной микрофлорой свежего кислосливочного масла длительного сквашивания являются молочнокислые стрептококки. После месячного хранения происходит незначительное увеличение посторонней микрофлоры.
В масле краткого сквашивания – сладкосливочном (при несколько более низкой кислотности плазмы) в начале хранения основную микрофлору составляют молочнокислые бактерии, но в процессе хранения наблюдается более сильное, чем в масле длительного сквашивания, развитие посторонних бактерий.
В длительно хранившемся масле наблюдается повышенное количество дрожжей. Чаще всего встречаются виды, несбраживающие молочный сахар, медленно развивающиеся в масле. Дрожжи, сбраживающие молочный сахар, преобладают в свежем масле, но в процессе его хранения они быстро отмирают.
Повышение стойкости масла
Повышать стойкость масла при хранении можно путем использования бесспоровых дрожжей (род Тоrulopsis). Они не сбраживают лактозу и другие сахара – по типу спиртового брожения; не вызывают разложения белков и жира. Используют виды, быстро развивающиеся на поверхности, и другие – во внутренних слоях монолита. Первые подавляют рост плесневых грибов на поверхности, другие задерживают окислительные процессы внутри монолита масла.
Биотехнология сыров
Микробиологическая сущность сыроделия. Процесс сыропроизводства включает в себя следующие операции: образование казеинового сгустка и его обработку, прессование и придание сырной массе определенной формы, посолку и созревание продукта. Для производства сыров используют пастеризованное и сырое молоко. Парное молоко непригодно. Во время пастеризации уничтожаются микроорганизмы, которые могут быть причиной вспучивания сыров и других пороков. Однако нагревание молока замедляет процесс свертывания, т.к. при этом происходит осаждение солей кальция.
Свертывание молока (метод получения белка в сыроделии) осуществляется с помощью молочнокислых микробов (при выработке кисломолочных сыров) и микробов в сочетании с сычужным ферментом (при выработке других видов сыров). Под действием микробов в сырной массе происходят сложные биохимические процессы: созревание, формирование органо-лептических и других свойств, характерных определенному виду сыра. Из пастеризованного молока сыр можно приготовить путем внесения чистых культур молочнокислых бактерий (закваски). Для каждого вида сыра должна быть своя закваска.
При выработке твердых сычужных сыров бактериальную закваску вносят в количестве 0,2-0,5 %, при изготовлении мягких сыров – 3-5 %. В состав бактериальных заквасок входят кислотообразователи (Str. lactis и Str. cremoris), а также микробы, образующие кислоту и ароматические вещества (Str. dlacetilactis, Str. paracitrovorum).
В зависимости от режима технологии применяют также Lactobact. helviticum, Str. thermophilus и др., из антагонистов маслянокислых бацилл – Lactobact. plantarum.
Сычужный фермент получают из сычугов 2-3-недельных телят. Он представляет собой порошок, который вносят в молоко для получения сгустка (геля). Активность сычужного фермента должна быть 1:100000, т.е. при температуре 35°С в течение 40 мин. 1 г фермента должен свернуть 100000 г (100 кг) молока. В промышленности применяют более высокую концентрацию фермента 2,5:100000, т.е. 2,5 г на 100 кг молока. Оптимальная температура действия фермента 40-41°С, рН 6,2. Ускорение действия фермента происходит при добавлении на 100 кг молока 15-20 г хлорида кальция.
Сущность созревания сыров. Сычужный фермент вызывает начальное разложение белков (до пептонов), а более глубокий распад (до аминокислот и аммиака) происходит под воздействием ферментов, выделяемых молочнокислыми бактериями.
Таблица 1 – Влияние сычужного фермента и микроорганизмов на созревание сыров
Виды сыров |
В процессе созревания участвуют |
Кисломолочные сыры (без созревания) |
Молочнокислые бактерии |
Сыры с низким вторым нагреванием (латвийский, голландский) |
Сычужный фермент, мезофильные молочнокислые бактерии, микрофлора слизи (Bact. linens, микрококки, дрожжи) |
Сыры с высоким вторым нагреванием (российский, швейцарский) |
Сычужный фермент, мезофильные молочнокислые бактерии, пропионовокислые бактерии |
Плесневые сыры: |
|
закусочный |
Сычужный фермент, мезофильные молочнокислые бактерии и плесневые грибы (Penic. candidum, Penic. camemberi) и бактерии красного цвета |
рокфор |
Сычужный фермент, мезофильные молочнокислые бактерии и плесневые грибы (Penic. roqueforti) |
Степень разложения молочного сахара и казеина при созревании сыров неодинакова:
Молочный сахара →сбраживается полностью, казеин →превращается в растворимое состояние: в твердых сырах – 1/3 часть, в мягких – почти весь.
Созревание полутвердых и твердых сыров протекает от внутренней части к поверхности. Мягкие сыры созревают от поверхности в глубину. В твердых сырах распад белков более глубокий, чем в мягких.
Сыры, созревающие при участии мезофильных молочнокислых бактерий.
Латвийский сыр и сыры голландского типа. Количество бактерий в 1 г сыров с низким вторым нагреванием уже в первые дни созревания достигает нескольких миллиардов (в латвийском – 8,8, в голландском – 3,5 млрд.).
Быстрый рост бактерий в сыре продолжается до тех пор, пока в нем есть молочный сахар; после его расходования (обычно через 5-7 дней) количество бактерий постепенно снижается.
В обоих сырах во время созревания преобладают молочнокислые стрептококки, и лишь к концу его усиливается развитие молочнокислых палочек, потребляющих продукты разложения белков.
На созревание латвийского сыра большое влияние оказывает микрофлора слизи, находящейся на поверхности, в состав которой входят, кроме молочнокислых бактерий, дрожжи, микрококки, плесневые грибы, протеолитические бактерии (типа Васt. lines). В первые дни созревания сыра вследствие кислой реакции в слизи бурно развиваются дрожжи и плесневые грибы, а затем, после установления нейтральной реакции, усиливается развитие микрококков и протеолитических бактерий. Возможно, что это происходит не только из-за снижения кислотности, но и вследствие обогащения среды ростовыми веществами и витаминами после отмирания и автолиза дрожжей. Протеолитические ферменты, накапливающиеся в слизи, диффундируют во внутренние слои сыров, ускоряя процесс разложения белков. При этом в подкорковом слое белки разлагаются быстрее, чем в центральной части, что подтверждается более выраженным вкусом подкоркового слоя сыра.
Чеддар. Температура второго нагревания, применяемая при его выработке, обычно не превышает 40-45°С, что способствует быстрому размножению молочнокислых бактерий. Второй особенностью, еще в большей степени способствующей усиленному размножению молочнокислых бактерий является чеддаризация сырного пласта (выдерживание в течение нескольких часов до нарастания необходимой кислотности). Все это создает специфический (кисловатый) вкусовой букет сыра чеддар.
В первые дни созревания чеддара преобладают молочнокислые стрептококки; количество их в 1 г сыра достигает миллиардов, после чего наступает постепенное вымирание, продолжающееся до конца созревания.
Развитие молочнокислых палочек протекает по-иному: в процессе созревания происходит постепенное увеличение их количества. Основная роль среди мезофильных молочнокислых палочек в процессе созревания чеддара принадлежит стрептобактериям (Lactob. plantarium).
По интенсивности распада белков чеддар близок к швейцарскому сыру.
Сыры, созревающие при участии термофильных молочнокислых бактерий.
Основное отличие российского и швейцарского сыров заключается в высокой температуре второго нагревания, которая вызывает резкое подавление размножения и даже частичную гибель молочнокислых стрептококков, несколько замедляя в то же время и темп развития термофильных молочнокислых палочек.
Охлаждение этих сыров вследствие их большого размера происходит медленно. Выдерживание в бродильном подвале (температура выдержки российского сыра 20-25°С, швейцарского – 18-25°С) также способствует сохранению повышенной температуры внутри сыров. В результате этого в российском и швейцарском сырах обильно развиваются термофильные молочнокислые палочки.
По количеству бактерий, действующих в процессе созревания, и скорости их размножения эти сыры значительно уступают латвийскому и голландскому.
При изучении динамики микробиологических процессов при выработке и созревании швейцарского сыра установлены следующие изменения в составе его микрофлоры. Количество мезофильных молочнокислых бактерий (стрептококков и палочек) увеличивается в начале выработки, а при втором нагревании вследствие высокой температуры снижается до 10% от начального количества. При прессовании количество их вновь возрастает, достигает максимума (свыше 1 млрд. в 1 г), а затем постепенно снижается.
Количество молочнокислых стрептококков в первые дни созревания повышается параллельно с увеличением количества молочнокислых бактерий. В последующем ускоряется вымирание молочнокислых стрептококков.
На развитие термофильных молочнокислых стрептококков второе нагревание оказывает меньшее влияние: рост их продолжается при прессовании. При посолке отмечается снижение роста, но при выдержке сыров в бродильном подвале количество термофильных стрептококков вновь увеличивается.
Мезофильные молочнокислые палочки (стрептобактерии) при выработке сырной массы вследствие своей малой активности развиваются слабо. В начале созревания количество их постепенно увеличивается и только через месяц несколько снижается. В течение последующего периода созревания сыра наблюдается незначительное их вымирание, однако и при этом их количество превышает число молочнокислых бактерий. Это указывает на большую роль стрептобактерий в процессе созревания швейцарского сыра.
Пропионовокислые бактерии размножаются в сыре в значительном количестве в период выдерживания его в бродильном подвале. Рост их продолжается в течение всего периода созревания. В результате пропионовокислого брожения в сыре образуются специфический вкус и запах швейцарского сыра, а также характерный рисунок (крупные «пузырьки»).
В российском сыре вследствие более низкой температуры второго нагревания (50-54°С) и большего содержания влаги микробиологические процессы протекают энергичнее, чем в швейцарском. Поэтому российский сыр созревает быстрее швейцарского: если для созревания последнего требуется около 7-9 месяцев, то в российском сыре этот процесс заканчивается через 4 месяца.
Плесневые сыры. Плесневые сыры обладают специфическим вкусом и запахом, отличающимися от вкуса и запаха сыров других видов. Своеобразие вкуса обусловлено разложением не только молочного сахара и белков, но и жира. Жир разлагается плесневыми грибами, специально вносимыми при выработке этих сыров.
Плесневые грибы для закусочного сыра выращивают на пшеничном хлебе, для рокфора – на ржаном.
Закусочный сыр. Микробиологические процессы при созревании закусочного сыра протекают очень интенсивно, вследствие чего созревание заканчивается в течение месяца.
В качестве специальных культур применяют (путем опрыскивания поверхности) Реnicillum candidum с бесцветными спорами и Реnicillum camemberti , имеющих слегка окрашенные споры. Колонии у первого гриба белого цвета, у второго – споры вначале также белого цвета, но с возрастом приобретают слегка голубоватый, затем кремовый оттенок.
Во внутренних слоях сыра вначале происходит бурное размножение молочнокислых стрептококков, количество которых уже в первые дни созревания достигают максимума (около 6,5 млрд. в 1 г), затем наступает резкое вымирание, и приблизительно через 10 дней количество их постепенно снижается до сотен миллионов. В закусочном сыре молочнокислые палочки размножаются значительно интенсивнее, чем в латвийском и голландском. Через 15 дней их количество достигает нескольких млрд. в 1 г.
На поверхности закусочного сыра с первых дней наблюдается пышное развитие дрожжеподобного грибка рода Саndida. Позднее развиваются плесневые грибы, которыми специально обсеменяется поверхность сыра: иногда наблюдается развитие обычных плесневых грибов (Реnicillum glaucum, Еndomices lactis).
Саndida и плесневые грибы обладают сильными протеолитическими свойствами. Разлагая казеин, они нейтрализуют кислоту на поверхности сыра, создавая благоприятные условия для развития аэробных щелочеобразующих бактерий.
Рокфор. Рокфор вырабатывают из овечьего и коровьего молока. В процессе созревания, кроме молочнокислых бактерий, участвует специально добавленный плесневый грибок Реnicillum roqueforti, близкий к обычному плесневому грибу зеленого цвета (Реnicillum glaucum).
Споры плесневого гриба вносятся путем послойного обсеменения сырного зерна при формовании.
По характеру развития микрофлоры рокфор приближается к закусочному сыру. Наибольшее количество бактерий (около 5,5 млрд. в 1 г) наблюдается в первые дни созревания: к 15-му дню, как и в закусочном сыре, количество бактерий резко снижается, достигая сотен миллионов в 1 г. После этого наступает медленное затухание бактериальных процессов.
Созревание рокфора в первые дни протекает главным образом под воздействием ферментов молочнокислых стрептококков: после 10 дней в этом процессе принимают участие молочнокислые палочки (из группы стрептобактерий), количество которых в этот период даже превышает количество молочнокислых стрептококков. Такое быстрое их размножение обусловлено, по всей вероятности, развитием плесневого гриба внутри сыра. Помимо разложения жира, плесневые грибы разлагают белки, снижая тем самым кислотность сыра. Последнее способствует усиленному размножению молочнокислых палочек в первый период созревания, что характерно для сыров с низким вторым нагреванием.
Специфический первичный вкус рокфора обуславливается накоплением летучих жирных кислот (капроновой, каприловой и их солей) и образующихся из них метилкетонов. Сыры с нормальным развитием поверхностной микрофлоры содержат больше летучих кислот и аминного азота, имеют более чистый вкус и лучшую консистенцию по сравнению с теми сырами, на поверхности которых наблюдалось недостаточное развитие микрофлоры.
Ускорение созревания сыров
Для ускорения созревания сыров предложено (Альтмери) применять концентрированный фермент молочнокислых бактерий (ацидофермент). Сущность метода заключается в получении автолизатов, содержащих ферменты различных видов молочнокислых бактерий. При ускорении процесса созревания должен сохраняться типичный вкусовой букет сыра данного вида. В состав препаратов должны входить ферменты тех молочнокислых бактерий, которые принимают участие в созревании того или иного вида сыра.
При получении ферментов для сыров с низким вторым нагреванием необходимо использовать мезофильные молочнокислые стрептококки (Str. lactis и Str. cremoris), ароматообразующие бактерии и молочнокислые палочки (стрептобактерии). Для сыров с высоким вторым нагреванием следует применять препарат ферментов, полученных из культур термофильных молочнокислых стрептококков (Str. thermophilus) и палочек (Lactob. helveticum).
Ускорение созревания сыров должно осуществляться путем создания благоприятных условий для развития молочнокислых бактерий и более длительного сохранения их в активном состоянии. Для этого можно применять «гидролизованную» закваску. Сущность данного метода заключается в том, что в молоко для приготовления закваски вносят одновременно сычужный фермент и чистые культуры молочнокислых бактерий; под действием сычужного фермента в закваске усиливается накопление растворимых форм белков. Последнее усиливает размножение молочнокислых бактерий не только в закваске, но и в самом сыре, т.к. при внесении ее в молоко сыр уже в свежем состоянии будет содержать больше растворимых азотистых соединений.
Для активирования молочнокислых бактерий можно вносить в молоко, идущее на выработку сыров, культуры дрожжей, не сбраживающих молочный сахар.
Биотехнология молочных консервов и мороженого
При производстве молочных консервов и мороженого применяют следующие способы борьбы с микроорганизмами (уничтожения, прекращения или замедления их размножения):
• тепловая обработка (115-118°С) при производстве сгущенного стерилизованного молока – уничтожение клеток микробов и их спор;
• удаление влаги при производстве сухого молока – вызывает явление плазмолиза в клетках и прекращает их развитие;
• добавление сахара при производстве молока с сахаром – оказывает действие, сходное с высушиванием, но более слабое; некоторые микроорганизмы, хотя и очень медленно, размножаются при хранении этого продукта;
• воздействие на продукт отрицательной температуры (-18°С) при производстве мороженого прекращает развитие микроорганизмов.
Микробиологические процессы в молочных консервах играют только отрицательную роль, поэтому условия выработки данных продуктов должны способствовать или полному уничтожению микроорганизмов (сгущенное стерилизованное молоко), или прекращению развития в процессе хранения (сгущенное молоко с сахаром, сухое молоко).
Сгущенное стерилизованное молоко. В производственных условиях применяют термическую обработку сгущенного в 2-2,5 раза молока при температуре 115-118°С в течение 15 мин.
Возбудителями пороков являются главным образом споровые палочки, которые могут выдерживать высокую температуру. Свертывание молока чаще всего вызывают споровые аэробные бактерии (Васillus coagulans, Bacillus cereus). Бомбаж вызывают анаэробные споровые бактерии, обладающие способностью сбраживать молочный сахар с образованием газа, вызывающие глубокое разложение белков маслянокислые бактерии (Сlostridium amylobacter) и гнилостные анаэробные бактерии (Сlostridium putrificus). При гнилостном разложении белка сгусток молока оседает на дно, сверху остается мутная сыворотка. При образовании газа сгусток плавает на поверхности сыворотки. В некоторых случаях молоко приобретает гнилостный запах (при этом сгусток полностью разлагается).
Сгущенное молоко с сахаром. Стойкость данных молочных консервов достигается не стерилизацией, а добавлением сахарозы (в количестве 18 % по отношению к сырому молоку). При таком количестве сахара подавляется жизнедеятельность большей части микрофлоры молока, а, следовательно, значительно повышается стойкость хранении.
Ухудшают качество сгущенного молока с сахаром шоколадно-коричне-вая плесень и цветные микрококки. Они вызывают появление в молоке сырного вкуса. Источником обсеменения продукта этими микроорганизмами являлся сахар.
Сухое молоко. Сухое молоко является наиболее стойким молочным продуктом. В нем содержится не более 7 % влаги (в негерметичной упаковке). При этих условиях микроорганизмы не могут размножаться, и изменения качества, которые наблюдаются при хранении сухого молока, происходят под воздействием главным образом физико-химических факторов (свет, повышенная влажность и др.).
Сухое молоко получают пленочным и распылительным способами. При пленочном способе применяется более высокая температура (около 100°С), в результате чего в молоке сохраняется значительно меньше микробов (споры бактерий), чем при распылительном способе сушки при температуре 65-70°С (кроме споровых бактерий, содержатся микрококки, молочнокислые бактерии и др.).
Чем меньше влаги в сухом молоке, тем лучше сохраняются его первоначальные свойства.
Общее количество бактерий в 1 г сухого молока (распылительного и пленочного) допускается: не более 50000 – для молока высшего сорта и 100000 – для первого сорта. Содержание патогенных бактерий и кишечной палочки не допускается.
Мороженое. Смесь, из которой вырабатывают мороженое, составляют из молочных продуктов (цельное, сгущенное и сухое молоко, сливки и масло), желатины или агара, сахара, изюма, яиц (или меланжа), кофе, какао, шоколада, миндаля, орехов, ванилина, крахмала и др. Основными источниками микрофлоры являются молоко и молочные продукты, а также яйца (особенно меланж), где могут присутствовать сальмонеллы и b-гемолитические стрептококки. Орехи часто заражены дрожжами и плесневыми грибами.
В процессе охлаждения смеси вследствие его непродолжительности количество бактерий обычно не увеличивается.
Совершенствование технологии и улучшение санитарных условий производства мороженого способствуют снижению его бактериальной обсеменености. Бактерии бруцеллеза могут сохраняться в мороженом при температуре -23ºС свыше 7 лет, бактерии туберкулеза – в течение 6,5 лет, бактерии брюшного тифа – при температуре -12…-22ºС сохраняются в течение 2,5 лет.
3.3. Биотехнология мясных продуктов
Изменение микрофлоры мяса и мясопродуктов при их хранении и посоле. Мясо и мясопродукты являются хорошей питательной средой для развития микроорганизмов. Поэтому в целях сохранения качества мяса и мясопродуктов их подвергают посолу, холодильному хранению и другим видам консервирования.
Изменение микрофлоры мяса при холодильном хранении
Микрофлора охлажденного мяса. В камерах охлаждения температуру перед загрузкой мяса поддерживают от -1 до -3°С, а во время охлаждения – от -1 до 0°С. Относительная влажность воздуха в начале охлаждения 95-98 %, а после окончания загрузки и до конца охлаждения – 90-92 %. Во время охлаждения испаряется влага, и температура мяса (туши) снижается. К концу процесса охлаждения температура в мясной туше (в ее глубоких слоях) становится близкой к температуре воздуха в камере. Поверхностный слой туши подсыхает, образующаяся корочка препятствует росту микрофлоры и проникновению ее вглубь тканей туши.
Микрофлора мяса, поступающего на хранение в камеры охлаждения, разнообразна по составу и обычно представлена мезофилами, термофилами и психрофилами, т.е. микроорганизмами, имеющими неодинаковые температурные пределы роста.
К концу охлаждения в глубоких слоях мяса температура должна достигать 0-4°С. Следовательно, на охлажденном мясе в процессе хранения могут развиваться только психрофильные микроорганизмы.
Термофильные и большинство мезофильных микроорганизмов, которые не развиваются при температурах, близких к 0°С, после охлаждения мяса полностью приостанавливают свою жизнедеятельность, переходя в анабиоз. В процессе последующего хранения продукта эти микроорганизмы постепенно отмирают. Но некоторые патогенные и токсигенные бактерии из группы мезофилов (сальмонеллы, стафилококки и др.) длительное время сохраняют жизнеспособность при низких температурах и не отмирают при хранении охлажденного мяса.
Размножение микроорганизмов в мясе при низких температурах проходит несколько фаз (лаг-фазу, логарифмическую, максимальную стационарную и фазу отмирания). В начальный период хранения охлажденного мяса психрофилъные микрорганизмы, находясь в лаг-фазе (фазе задержки роста), некоторое время не размножаются или размножаются незначительно.
При соблюдении установленного температурно-влажностного режима (относительная влажность 85-90 %, температура воздуха от -1 до 1°С) на охлажденном мясе, полученном в результате убоя здоровых животных, размножение микроорганизмов задерживается на 3-5 дней и более.
По истечении лаг-фазы начинают усиленно размножаться психрофильные микроорганизмы (логарифмическая фаза), и их число резко возрастает. При этом первое место из психрофильных неспорообразующих форм микроорганизмов занимают бактерии, относящиеся к группам Pseudomonas и Achromobacter. В значительно меньшем количестве встречаются Flavobacterium, реже и в небольшом количестве – Alcaigenes, Аerobacterium и некоторые микрококки.
Вначале эти микроорганизмы размножаются на более влажных местах туши, образуя отдельные колонии, а затем они сливаются в виде сплошного мажущегося слизисто-мутного серого налета. Количество бактерий на мясе к моменту появления слизи, по различным источникам, колеблется от 3 млн. до 32-50 млн. на 1 см2. На мясе, покрытом толстой пленкой слизи, количество бактерий достигает 109-1010 на 1 см2. При хранении мяса в условиях температуры выше 5°С в образовавшейся слизи, помимо микробов группы Pseudomonas и Achromobacter, встречаются дрожжевые клетки, актиномицеты, палочка протея, микрококки и др.
При длительном хранении мяса в охлажденном состоянии некоторые виды бактерий группы Pseudomonas образуют слизь зеленоватого или бурого цвета. Такая же окраска придается и продукту. Во время роста бактерий из группы Pseudomonas и Achromobacter используют большое количество кислорода, вследствие чего ощущается недостаток кислорода на поверхности туши, что способствует потемнению мяса. Изменение окраски мяса может быть вызвано также окислением гемоглобина мышц до метгемоглобина.
Перечисленные изменения снижают товарный вид мяса, но не являются вредными для здоровья человека и незначительно влияют на вкусовые свойства продукта.
Психрофильные микроорганизмы, способные активно размножаться, со временем становятся преобладающими в составе микрофлоры продуктов, хранящихся в данных условиях.
В условиях, неблагоприятных для развития психрофильных аэробных бактерий (пониженная влажность и более низкая температура хранения), наблюдается активный рост плесневых грибов и аэробных дрожжей, которые имеют более низкие температурные пределы роста и менее требовательны к влажности.
Из плесневых грибов находятся представители из рода Penicillum, Мuсоr, Аspergillum, Сladosporium и Тhamnidium. Из дрожжей встречаются преимущественно розовые дрожжи (Rhodotorula). Гриб из рода Тhamnidium вызывает образование неприятного запаха. Плесень Сladosporium gerbarum при развитии на мясе глубоко проникает в мышечную ткань туши, а во время удаления этой плесени с туши приходится срезать верхний слой мяса.
Гриб из рода Тhamnidium и Сladosporium gerbarum считается основным возбудителем порчи мяса в условиях хранения при температуре -4… -9°С, т.е. когда рост других плесневых грибов сильно задерживается. Причиной неприятного землистого запаха могут быть развивающиеся на мясе актиномицеты.
Помимо пороков (ослизнение, плесневение, появление постороннего запаха) на охлажденном мясе в мышцах около кости, в области бедра, иногда обнаруживается запах закисания. Это обусловливается размножением бактерий в анаэробных условиях в результате медленного охлаждения мяса.
Охлажденное при 0°С мясо обычно хранится не более 2-3 недель, что не позволяет перевозить мясное сырье на далекие расстояния.
Для предотвращения быстрой порчи мяса проводятся испытания по обработке его ионизирующим облучением. При соответствующих дозах достигается значительная задержка размножения микроорганизмов. Но пока не получено данных, которые можно было бы рекомендовать для практического применения. Из всех испытанных микроорганизмов, наиболее чувствительными к ионизирующему облучению оказались бактерии из группы Pseudomonas. Доза в 100 тыс. рентген при облучении гамма-лучами (Со60) вызвала гибель всех Pseudomonas на мясе; при этом мясо не имело особых изменений цвета, запаха или вкуса.
Углекислота также задерживает рост многих гнилостных бактерий, и применение ее целесообразно для удлинения сроков хранения мяса в охлажденном виде. Охлажденное мясо, хранившиеся в воздушной среде, содержащей 10% углекислоты, не подвергается порче в течение 60-70 дней (Загорянский). Продолжительность хранения мяса в охлажденном виде зависит от исходного содержания микроорганизмов на мясе, от температуры и влажности в камерах охлаждения.
При активном размножении микроорганизмов в результате их жизнедеятельности в конце стационарной фазы может наступить порча охлажденного мяса.
Микрофлора мороженого мяса. В случае необходимости длительного хранения мяса после охлаждения его замораживают. При замораживании из мяса вымораживается вода, превращаясь в кристаллы льда. Концентрация солей в мясе при этом увеличивается, а температура замораживания оставшихся соков понижается.
Так может продолжаться до тех пор, пока концентрация солей мясного сока не достигнет состояния, при котором вода больше не замораживается, а оставшиеся растворы минеральных солей и белков превращаются в однородную твердую массу.
Мороженым считается мясо, когда в толстой части мышц бедра на глубине 8-10 см температура не превышает -6°С.
Во время замораживания мяса отмирает значительное количество микроорганизмов, содержащихся в охлажденном мясе. Кроме низкой температуры на микроорганизмы губительно действуют высокая концентрация растворенных в продукте веществ и пониженная влажность, создающиеся в результате вымерзания воды, изменение содержащихся в клетках белков и механическое действие льда, образующегося вне клетки, а при быстром замораживании – и внутри клетки. Причем чем ниже температура (-18.. .-20°С) и выше скорость замораживания, тем больше погибает микроорганизмов.
Среди неспорообразующих бактерий энтерококки (фекальные стрептококки) и стафилококки более устойчивы к замораживанию чем другие виды. Наиболее устойчивы к действию низких температур плесневые грибы и дрожжи. Их грибница развивается примерно 3 месяца, споры – 4-5 месяцев. Причем чем выше влажность, температура и меньше движение воздуха, тем быстрее плесневые грибы развиваются.
В процессе хранения мороженого мяса отмирание микроорганизмов, выживших при замораживании, замедляется. Полного отмирания микроорганизмов в мороженом мясе не происходит. Большинство плесневых грибов и дрожжей на мороженом мясе при -18°С не погибают в течение 3 лет. При -15…-20°С токсигенные стафилококки сохраняют жизнеспособность на мороженом мясе до 30 дней, а сальмонеллы – до 6 месяцев и более. При -20°С содержание кишечной палочки уменьшается только через 6 месяцев, а энтерококков – остается практически постоянным в течение 9 месяцев хранения мороженых продуктов.
Минимальная предельная температура роста психрофильных микроорганизмов выше -10°С, поэтому при хранении мяса ниже этой температуры психрофилы, как и мезофильные микроорганизмы, не размножаются, а частично отмирают. В соответствии с этим по действующей в нашей стране технологической инструкции мороженое мясо рекомендуется хранить при -12°С и ниже, что позволяет сохранять его практически неограниченное время без признаков порчи.
Дефростированное мясо. Мороженое мясо перед употреблением подвергается оттаиванию (дефростации). Процесс оттаивания считается законченным, когда температура в толще мышц достигает 0°С. Размножение микробов на оттаянном мясе происходит быстрее, чем на мясе, не подвергавшемся замораживанию.
Микроорганизмы, выжившие в процессе хранения мороженого мяса, при его оттаивании начинают размножаться, т.к. происходит выделение мышечного сока и увлажнение поверхности мяса. Интенсивность размножения микроорганизмов во многом зависит от способа замораживания. При медленном неглубоком замораживании в мышечной ткани образуются крупные кристаллы льда, что обусловливает разрыв оболочек большого количества клеток мышечных волокон и выделение значительного количества мышечного сока. В результате быстрого глубокого замораживании в мышечной ткани образуются мелкие кристаллы льда, которые не травмируют оболочек окружающих их клеток ткани. После оттаивания мышечный сок проникает обратно в мышечные волокна и почти не выделяется. На активность размножения микроорганизмов во время размораживания влияет также температура. Если размораживание проводят при повышенной температуре (20-25°С), то к тому времени, когда оттают глубинные участки мышечной ткани, на поверхности туши происходит интенсивное размножение микробов. При медленном размораживании (низкой плюсовой температуре 1-8°С и относительной влажности 75-90%) микроорганизмы размножаются на поверхности мясных туш менее активно.
Изменение микрофлоры мяса при посоле
При посоле под влиянием высокой концентрации хлорида натрия, пониженной температуры и антагонистических взаимоотношений микроорганизмов различных видов резко изменяется количественный и групповой состав микрофлоры мяса. Наиболее существенные изменения обусловлены воздействием хлорида натрия. Он оказывает консервирующее действие, задерживая развитие многих микроорганизмов, что объясняется одновременным действием нескольких факторов:
• создаваемое солью высокое осмотическое давление вызывает обезвоживание тканей продукта. Вследствие обезвоживания и проникновения хлорида натрия снижается показатель σw (активность воды), в результате чего нормальная жизнедеятельность многих организмов невозможна;
• выделяемые из поваренной соли ионы хлора нарушают протеолитическую ферментативную деятельность микроорганизмов. Развитие Salmonella и Сl.botulinum прекращается при концентрации соли свыше 10 %. Сал-монеллезные бактерии отмирают при концентрации соли 19 % через 75-80 дней. Кокковые формы бактерий переносят концентрацию соли 15%. Стафилококки, вызывающие пищевые отравления, прекращают рост при концентрации 15-20 %, а при 20-25 % они отмирают. В результате плохой растворимости кислорода в рассоле создается низкая его концентрация, вследствие чего замедляется размножение аэробных микроорганизмов.
В мясе и рассоле могут содержаться микроорганизмы, имеющие различную чувствительность к хлориду натрия:
• несолелюбивые (негалофильные), которые размножаются при 1-2% и полностью прекращают свое развитие при 6-10% соли. К этой группе относят многие неспорообразующие грамотрицательные гнилостные бактерии, многие патогенные и токсигенные микроорганизмы;
• солеустойчивые (солетолерантные) хорошо размножаются при небольших концентрациях (1-2 %), дают слабый рост в средах, содержащих до 6-8 % хлорида натрия, и длительное время сохраняют жизнеспособность при высоких его концентрациях. К ним относят многие гнилостные аэробные бациллы, анаэробные клостридии, кокки, некоторые молочнокислые и патогенные бактерии;
• солелюбивые (галофилы) бывают двух типов: облигатные и факультативные. Облигатные размножаются только при высоких концентрациях соли (от 12% и выше) и совсем не растут на средах с низким содержанием хлорида натрия. Факультативные растут достаточно хорошо как при высоких концентрациях, так и в присутствии 1-2% соли. Галофилами являются многие плесени, некоторые дрожжи, многие пигментные микрококки, некоторые пигментные палочковидные бактерии и др.
Поскольку значительная часть микроорганизмов, содержащихся в рассоле, способна размножаться при высоких концентрациях хлорида натрия, посол следует проводить при пониженной температуре (не выше 3-5°С).
При посоле мяса и мясопродуктов в рассол вносят нитраты или нитриты, которые соединяются с красящим веществом мяса (миоглобином) и обусловливают красный цвет мяса. Оказывают ли нитраты или нитриты какое-либо действие на микробы – до настоящего времени точно не установлено. Однако при посоле без селитры наблюдается большой процент порчи продуктов.
Биотехнология колбасных изделий
Колбасные изделия представляют собой мясной продукт, который предназначен для употребления в пищу без дополнительной термической обработки.
Обработку мяса для колбасы начинают с обвалки (отделение мышечной ткани от костей) и жиловки (разборки его по сортам). При этом количество микрофлоры в мясе резко повышается. Увеличение количества микробов в мясе во время его обвалки происходит не за счет размножения их, а за счет обсеменения мяса с рук рабочих, с инструментов и оборудования, инвентаря и из воздуха помещения.
После обвалки и жиловки мясо солят. При этом вместе с посолочной смесью, состоящей из соли и селитры, в мясо могут попадать микроорганизмы. Чаще всего среди этих микроорганизмов встречаются: Вас.subtilis, Вас.mesentericus, Рseudomonas fluorescens, пигментные кокки, актиномицеты, споры плесневых грибов, некоторые галофильные микроорганизмы и др. Многие из этих микроорганизмов обладают протеолитическими свойствами.
Посол производят при температуре 2-4°С. Сроки посола – не более 1-3 суток для вареных и 5-10 суток – для сырокопченых колбас. При такой температуре в мясе мезофильные микробы не размножаются.
При измельчении посоленного мяса на волчке и при обработке фарша в смесительной машине может происходить размножение микробов, а при добавлении к нему шпика и специй фарш дополнительно обсеменяется микроорганизмами. Быстрому увеличению количества микробов в фарше способствует повышение его температуры до 18-22°С при измельчении. При этом в 1 г фарша число микроорганизмов может достигать сотен, тысяч и более. Поэтому машины для измельчения мяса (волчки, куттеры) и фаршемешалки перед работой проходят термообработку, а в фарш добавляют лед или холодную воду.
Шприцевание, или набивку оболочки фаршем нужно производить равномерно и плотно. При неплотной набивке (шприцевании) фарша внутри батона колбасы могут образовываться пустоты («фонари»), в которых скапливается влага, и создаются благоприятные условия для размножения микроорганизмов. Источником микробного обсеменения фарша при набивке могут служить колбасные оболочки, особенно естественные (мокросоленые, пресно-сухие). В мокросоленых кишечных оболочках обычно содержатся бактериум галофилум, различные виды микрококков, сарцины, аэробные бациллы, актиномицеты, плесневые грибы и другие, галофильные и солеустойчивые микроорганизмы. В пресно-сухих кишечных оболочках также часто находятся споровые аэробные гнилостные бациллы, актиномицеты, споры плесневых грибов и различные кокковые бактерии. Санитарная обработка кишечных оболочек перед использованием (очистка, дезинфекция) резко снижает микробное загрязнение. Искусственные оболочки более гигиеничны.
Батоны, набитые фаршем, подвергают осадке. Если во время осадки не нарушается технологический режим (температура не выше 2°С, относительная влажность 85-95% и продолжительность не более 2-4 ч.), то количество микробов в батонах остается без изменения. После осадки проводят обжарку колбас и затем их варку.
Обжарка. Обжарке подвергают, за исключением ливерных, все вареные и полукопченые колбасы, сардельки и сосиски. Под действием дыма с высокой температурой (80-110°С) в течение 0,5-2 ч. происходит подсушивание оболочки, и образуется сухая тонкая пленка. Создаются неблагоприятные условия для развития микробов на поверхности колбас.
Варку колбас начинают при высокой температуре (85-90°С), постепенно снижая ее до 75-87°С.
Остаточная микрофлора колбасных изделий после варки состоит в основном из спорообразующих палочковидных сапрофитных аэробных и анаэробных бактерий и незначительного количества неспорообразующих сапрофитных бактерий, главным образом кокков. Количество неспорообразующих микробов в вареных колбасах большого диаметра составляет обычно не более 10-12%, в батонах небольшого диаметра – только 4-7%, а в сосисках – всего 1-3% от общего числа микробов, выживших при варке.
Охлаждение. После варки колбасных изделий во избежание быстрого размножения в них остаточной микрофлоры и порчи их охлаждают под душем до температуры 30-35°С, а затем – в холодильной камере до 4°С.
Копчение и сушка. Групповой состав микрофлоры полукопченых колбас после копчения и сушки почти не изменяется. Общее количество микроорганизмов несколько уменьшается, поскольку часть микробов, выживших при варке, отмирает в процессе дополнительной обработки.
Общая микробная обсемененность (КОЕ) вареных и полукопченых колбас I и II сортов должна быть не выше 1000 и колбас III сорта – не выше 2000 микробных клеток в 1 г. В колбасах не должны содержаться патогенные и условно-патогенные микроорганизмы (кишечная палочка и палочка протея).
Сырокопченые и варено-копченые колбасные изделия готовят по особой технологии. При этом бактерицидными и бактериостатическими агентами являются соль, антисептические вещества коптильного дыма, которыми пропитывается продукт (формалин, фенол, альдегиды и др.).
Сырокопченые колбасы по сравнению с варено-копчеными и вареными значительно медленнее подвергаются порче. В них содержится меньше влаги (30-40%) и больше антисептиков. При изготовлении сырокопченых колбас батоны их подвергают длительной (5-7 суток) осадке, холодному копчению (при температуре 18-25°С) и сушке (до 1,5 мес.). Разновидностью сырокопченых колбас являются сыровяленые (вяленые) колбасы, которые после осадки сушат без предварительного копчения (вяление).
В начальных стадиях технологического процесса в сырокопченой колбасе чаще обнаруживают: из спорообразующих видов – Вас. subtilius, Вас.mesentericus, реже – Bас.megatherium и В.mycoides; из гра-мотрицательных видов – Васt.faecalis alcaligenes, Е. соli citrovorum, Е. соli, Рroteus vulgaris, реже – Е.aquatilis communis, Васt.cloacae и Васt.morgani. В готовой, хорошо созревшей сырокопченой колбасе встречаются совершенно другие микроорганизмы. Из кокковых форм чаще обнаруживают: Мicr. aquatilis, Str.cereus albus, Micr. pellicidum, Мicr.casei amori, Sarcine aurantiaca, реже – Мicr. Tetragenes tartissirnus, Мicr. chersonesia, Мicr. coralloides; из молочнокислых бактерий – Str. lactis и Еnterococci, lactobacterium plantarum.
Обычно в конце созревания сырокопченых и вяленых колбас молочнокислые бактерии и микрококки составляют наибольшую часть от общего количества микрофлоры продукта. Грамотрицательные бактерии, преобладающие в начальный период процесса, по мере созревания колбас постепенно отмирают; бактерии рода протеус отмирают и не обнаруживаются в фарше примерно к 18-30 дню, а кишечная палочка – через 30-50 дней сушки. В готовых созревших колбасах эти микроорганизмы, как правило, отсутствуют.
Изменение состава микрофлоры сырокопченых и вяленых колбас связано с тем, что на состав и развитие микроорганизмов воздействуют такие факторы, как обезвоживание среды, повышение концентрации соли и связанное с ними снижение активности воды, применение коптильных веществ (на поверхностную микрофлору сырокопченых колбас), изменение рН продукта и микробный антагонизм.
В процессе копчения продукт пропитывается антисептическими веществами коптильного дыма, подавляющими развитие неспорообразующих микроорганизмов. Споры аэробных бацилл, анаэробных клостридий и плесени обычно при копчении не погибают. Следовательно, коптильные вещества играют второстепенную роль в подавлении жизнедеятельности микрофлоры фарша. Бактерицидный эффект копчения заключается главным образом в создании бактерицидной зоны на поверхностных участках продукта, защищающей его от проникновения и размножения микроорганизмов извне.
Основная микрофлора сырокопченых и вяленых колбас (молочнокислые бактерии, микрококки, дрожжи) влияют на созревание и формирование специфического запаха, вкуса, цвета и других органолептических свойств продукта.
Для улучшения качества колбасных изделий в отдельных странах применяют некоторые виды бактерий в виде чистой культуры или смеси нескольких видов. В США при выработке сыровяленой колбасы (типа летней) используют культуру Рediococcus cerevisiae. Эту культуру выпускают в сухом виде (препарат «Ассеl»). В Германии при изготовлении сырокопченой колбасы с добавлением селитры применяют культуру микрококка Т-53, которую фирма «Мекл» выпускает под названием «бактофермента».
Некоторые бактериальные культуры (L.plantarum, M.aqwatilis, M.auranticus, Snr.lactis) при добавлении в колбасный фарш, значительно улучшают органолептические и санитарные показатели сыровяленных и сырокопченых колбас.