БИОТЕХНОЛОГИЯ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ (ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ КУРС)(ЧАСТЬ 2)

---

По механизму действия ферменты делят на 6 групп:

1. Оксидоредуктазы. Они катализируют окислительно-восстановительные реакции переноса атомов водорода и кислорода от одного вещества к другому (каталаза, дегидрогеназа, оксидаза и др.).

2. Трнсферазы. Катализируют перенос различных групп атомов (ацильной, метильной, фосфатной или аминогрупп) от вещества к веществу (протеинкеназа, пируваткеназы и др.).

3. Гидролазы. Катализируют реакции гидролиза, протекающие с расщеплением внутримолекулярных связей и присоединением воды в точке расщепления (амилаза, липаза, пептидаза и др.).

4. Лиазы. Катализируют реакции отщепление и присоединение групп атомов с образованием двойной связи (фумараза, альдолаза, аспартаза).

5. Изомеразы. Катализируют реакции внутримолекулярной перестройки (изомераза, глюкозоимераза и др.).

6. Лигазы. Катализируют соединение молекул с образованием новых связей с использованием связей молекул АТФ (ДНК-лигаза, синтетаза).

Ферменты синтезируются, как все белки, на рибосомах и накапливаются в цитоплазме и др. структурах, находятся на поверхности клетки, или выделяются в окружающую среду.

Принцип действия ферментов

Механизм действия ферментов состоит в снижении энергии активации, необходимой молекуле субстрата, чтобы вступить в реакцию. Согласно существующим теориям (промежуточных соединений, адсорбционной, цепных реакций) снижение энергии активации происходит в результате адсорбции реагирующих веществ на поверхности фермента с образованием промежуточного нестойкого соединения – фермент-субстратного комплекса, что приводит реагирующие вещества в напряженное состояние и способствует быстрому протеканию реакции. Фермент является начальным, или «запальным» фактором, в дальнейшем катализируемая им реакция протекает самостоятельно. Поэтому основная роль биокатализатора состоит в преодолении молекулами субстратов активационного барьера на более низком энергетическом уровне (рис. 9).

Рис. 9. Характеристика энергетического состояния катализируемой (1) и некатализируемой (2) реакции

Кроме того, в активном цен­тре сосредоточено много неполярных групп, и эта область действует как органический растворитель. Здесь же находится небольшое число заряженных полярных боко­вых групп аминокислот, реакционная способность которых выше в органическом растворителе, чем в водной среде. Имея большую гибкую молекулу, ферменты способны сосредоточить на небольшом участке необ­ходимые группы для осуществления конкретной реакции с суб­стратом.

У сложных ферментов, имеющих кофакторы, возможности взаимодействия с субстратом значительно увеличи­ваются. Соединение фермента с субстратом в каталитическом центре может происходить с помощью ковалентных связей, при участии электронов, с помощью водородных связей или более слабых взаимодействий, например сил Ван-дер-Ваальса. Причем фермент и субстрат в районе активного каталитического центра должны сблизиться до расстояния 1,5-2 нм. В этих условиях внутренние связи в молекуле субстрата ослабляются, и создается возможность для реакции с ферментом.

В водном растворе вещества реагируют только при столкнове­нии. Если бы не было ферментов, эти столкновения были бы край­не редки. Как известно, ферменты обладают очень высокой ката­литической активностью. Одна молекула фермента за 1 мин мо­жет прореагировать с тысячами и даже миллионами молекул специфического субстрата. Так, алкогольдегидрогеназа, катали­зирующая превращение ацетальдегида в этиловый спирт, превра­щает в 1 мин 4700 молекул субстрата, а фосфотриозоизомераза -500 тыс. молекул.

Для действия каждого фермента характерна оптимальная температура, при которой скорость реакции макси­мальна. Так, α-амилаза культуры Aspergillus oryzae имеет оптимум температуры 50-55°С. Оптимум температуры большин­ства используемых в биотехнологии ферментов микроорганизмов 30-40 °С. Оптимум действия одних ферментов, например пеп­сина, наблюдается в кислой среде (рН 2,0), других – в щелоч­ной, а у большинства ферментов – в нейтральной.

Активаторами многих ферментов являются цистеин и глутатион. Эти вещества восстанавливают дисульфидную связь, обра­зуя SH-группы, которые входят в состав каталитических цен­тров и часто определяют ферментативную активность. Ингиби­торы ферментов могут быть неспецифическими (например, соли тяжелых металлов, которые при связывании с белками осаждают их из растворов) или специфическими (например, синильная кислота, которая реагирует с определенными химическими группами ферментов и ингибирует железосодержащих дыхательных ферментов).

Промышленное производство ферментов

Промышленным способом чаще всего получают ферменты группы гидролаз. Рассмотрим их производство на примере протеолитической группы.

Ферменты из растительного сырья. В промышленных условиях ферменты из растений получают в суб­тропических и тропических странах. Для этого используют такие растения, как папайя, ананас и инжир. Плоды папайи в стадии молочной зрелости содержат в соке значительное количество протеолитических ферментов. В этот период собирают сок плодов па­пайи. Для этого острым ножом сверху вниз слегка надсекают пло­ды, которые на деревьях образуют грозди. Плоды остаются на де­ревьях, а под гроздь подвешивают ведро, в которое стекает сок в течение суток или нескольких часов. Затем сок, который чаще на­зывают латексом, тонким (1-1,5 см) слоем разливают в плоские емкости и ставят в теплое место, в солнечный день обычно в тени. Латекс быстро высыхает, образуя тонкие пластины, которые легко снимаются. Их можно измельчить для получения технического препарата – папаина, а можно сразу подвергнуть очистке всеми известными методами: осаждением органическими растворителя­ми, высаливанием, концентрацией с помощью ультрафильтрации. Можно также использовать современные тонкие методы очистки, т. е. использовать общепринятые способы получения высокоочи­щенных препаратов вплоть до кристаллических и гомогенных ферментов.

Вторым по объему производства протеолитическим фермен­том растительного происхождения является бромелаин (бромелин). Его получают из листьев, стеблей и оболочек плодов ана­наса.

После уборки урожая всю зеленую массу, за исключением кор­невой части растения, измельчают и подвергают водной экстракции. Затем полученный экстракт обрабатывают в зависимости от дальнейшего применения.

Третьим известным препаратом растительной протеиназы яв­ляется фермент фицин, который получают из листьев и молодых побегов инжирного дерева. Особенность получения препарата заключается в том, что сырье собирают вручную ранним утром на восходе солнца в деревянную тару. Затем материал давят в любых емкостях, приспособленных для сбора и хранения, исключая кон­такт с металлом, и экстрагируют водой. Экстракт концентрируют. Жидкий концентрат можно использовать для смягчения мяса не­посредственно перед кулинарной обработкой, при производстве специальных колбас и копченых мясных изделий.

В умеренном климатическом поясе растительные амилолетические ферменты для пищевой промышленности получают из проросшего зерна – солода. Солод используют либо сырым в размолотом виде, либо в сухом виде. В промышленных масштабах очищенные ферментные препараты из солодов не производят.

Получение ферментных препаратов из животного сырья. В про­мышленных условиях при переработке мяса различных животных в самый первый момент разделки туши производят сбор фермент­ного сырья (поджелудочная железа, слюнные железы, слизистая оболочка желудков и тонкого кишечника, сычуги крупного рога­того скота и овец, семенники половозрелых животных).

Слизистая оболочка желудков свиней и крупного рогатого ско­та содержит пепсин и липазу, слюнные железы – амилазу, сычуг молодняка – сычужный фермент и т. д.

Свежеотобранные органы и ткани животных, содержащие фер­менты, очень нестойки при хранении. Поэтому после сбора сырье следует немедленно переработать или законсервировать с помощью низких температур, обработки поваренной солью, ацетоном, этиловым спиртом или же высушиванием.

Для получения технических препаратов допускается консерви­рование животного сырья поваренной солью. Этот метод исполь­зуется, например, при получении панкреатина.

Из заготовленного на мясокомбинатах животного сырья на специальных заводах органопрепаратов получают ферментные препараты различной степени очистки. Процесс получения их складывается из ряда последовательных операций: измельчение сырья, экстракция ферментов, высаливание, отделение белковых осадков от жидкой фазы, очистка, кристаллизация и сушка препа­ратов.

В зависимости от вида используемого сырья применяют раз­личные методы измельчения и разрушения клеток. К ним относят: попеременное за­мораживание и оттаивание, автолиз, обработ­ку дубильными веществами, органическими растворителями и др. Клеточные оболочки и ткани, содержащие большое количество влаги, можно разрушить механическим измельчением и прессова­нием.

В настоящее время используют механическое измельчение сы­рья на специальных мясорубках, волчках, куттерах и машинах, на которых можно получить тончайшие срезы с замороженного сы­рья (микротомы).

При измельчении животного сырья не обязательно стремиться к очень тонкому помолу, так как это может значительно затруд­нить дальнейшую переработку сырья. Тонкое измельчение может привести к образованию устойчивых суспензий за счет стабилизации их высокомолекулярных соединений, содержание которых в растворе резко возрастает по мере увеличения степени измельчения сырья.

Извлечение ферментов из измельченной животной ткани можно проводить тремя видами экстрагентов: водным ра­створом кислот при рН 1,0-2,0; водой или водными растворами солей при рН 7,0-8,0; концентрированным водным раствором органических растворителей (этанол, метанол, ацетон, глицерин).

Экстракцию проводят ступенчато, 2-3 раза заливая обрабатывае­мое сырье экстрагентом. Для лучшего извлечения ферментов всю массу в процессе экстракции перемешивают. После каждого на­стаивания обрабатываемого сырья экстрагент отделяют центрифу­гированием. Если выделяе­мый фермент очень нестабилен, то вместо центрифугирова­ния используют фильтрацию под вакуумом.

Методы выделения и очистки ферментов и экстрактов животных тканей незначительно отличаются от получения ферментных препаратов из культур микроорганизмов. Их выделяют осаждением органическими растворителями (этанол, метанол, изопропанол, ацетон, хлороформ и др.), солями (сульфат аммония, натрия или магния, ацетат натрия, хлорид натрия). В дальнейшем для более полной очистки используют диализ, ультрафильтрацию, адсорбцию.

Ферменты микробиологического происхождения.

В связи с увеличивающимися потребностями в фермент­ных препаратах растительное и животное сырье не устраивает производителей. Содержание ферментов в растениях, как пра­вило, низкое. Кроме того, получение ферментов из растений носит сезонный характер. Органы животных также можно получить только на мясокомбинатах, при этом возникают проблемы с консервированием и хранением этого вида сырья.

Единственным неограниченным источником ферментов являются микроорганизмы, из которых можно выделить любые из известных в настоящее время ферментов, за исключением папаина.

Синтезируемые микроорганизмами ферменты подразделяют на внеклеточные и внутриклеточные. К внеклеточным относят амилазу, целюлазу, лактазу, липазу, пектиназу, протеазу, к внутриклеточным – аспарагиназу, каталазу, инвертазу.

Внеклеточные ферменты получают из культуральной жидкости, предварительно отделенной от микроорганизмов. Для выделения внутриклеточных ферментов разрушают клеточные оболочки физическими или химико-ферментативными методами (гидролиз, ферментолиз, автолиз и др.). Далее выделение ферментов внутриклеточного и внеклеточного происхождения идет по одинаковой схеме. Вначале ферменты выделяют методами экстракции, осаждения, адсорбции, ионного обмена, ультрафильтрации и др., а затем очищают при помощи хроматографии, диализа и кристаллизации (см. лекцию № 4). При необходимости ферменты концентрируют, обезвоживают, модифицируют и стабилизируют.

Современные методы генетики и генетической инженерии позволяют целенаправленно увеличивать выход необходимого фермента. Кроме того, среди микроорганизмов можно найти формы, живущие в экстремальных условиях (термофилы, галофилы и др.). Это означает, что из микроорганизмов можно выделить ферменты с улучшенными свойствами – термостабильные, осмоустойчивые, кислото- и щелочеустойчивые.

Иммобилизованные ферменты

В клетках ферменты обычно находятся не в растворенном состоянии, а локализованы в органеллах клеток. Это связано с тем, что ферменты являются нестабильными соединениями и при химическом воздействии могут быстро инактивироваться, они достаточно чувствительны к рН среды, температуре. Кроме того, свободные ферменты могут быть использованы лишь один раз, и цена их достаточно высока.

Поэтому актуальным является производство иммобилизированных (связанных) ферментов.

Идея создания «нерастворимых», или «связанных» ферментов, которые позднее стали называть иммобилизованными возникла еще в 1950-х годах. К ее реализации имел отношение бывший президент Израиля Э. Качальский-Катцир. Мы привыкли, что президентами становятся политики, хозяйственники, юристы. Но этот человек до своего избрания был ученым-биохимиком и после пребывания на президентском посту вернулся в науку и до своей смерти в 1995 г. возглавлял институт биотехнологии в Тель-Авиве.

Иммобилизация – это прикрепление фермента к нерастворимому носителю, причем таким образом, чтобы фер­мент мог обмениваться с раствором молекулами субстрата и про­дукта.

При этом появляется про

стая возможность отделять и многократно использовать такой иммобилизованный фермент. Кроме того, оказалось, что закрепленный фермент сохраняется в актив­ном состоянии гораздо дольше, чем свободный, растворенный.

Методы иммобилизации ферментов

1. Адсорбция на носителе (рис. 10.А). Носителями могут быть неорганические материалы (стекло, силикагель, бенто­нит, оксид алюминия, диоксид титана и др.), природные полиме­ры (целлюлоза, коллаген) и синтетические полимеры (нейлон, по­лиэтилен, полипропилен).

2. Включение в гель агар-агара, альгинатов, карагинана (типа желе) (рис. 10.Б).

А Б

Рис. 10. Иммобилизация фермента методом адсорбции (А), методом включения в гель (Б): 1 – гранула носителя; 2 – молекула фермента.

Молекулы фермента сидят в порах геля. Гель проницаем для молекул субстрата и продуктов реакции за счет молекулярной диффузии.

3. Ковалентное связывание с носителем. Но­сителем в этом случае является полимерный материал, длинные молекулы которого в разных местах связаны химическими ковалентными связями с молекулами фермента (рис. 11.А).

4. Поперечная «сшивка» молекул фермента при помощи бифункциональных реагентов. Молекулы фермента, свободно перемещающиеся в растворе, соединяются между собой различными своими участками с помощью определенных реаген­тов (рис. 11.Б).

А Б

Рис. 11. Иммобилизация фермента методом ковалентного связывания с носителем (А); методом поперечной «сшивки» (Б).

Получается некое пространственное образование, включающее активные молекулы фермента и довольно большие пространства между ними, удобные для диффузии молекул субстрата и продукта реакции.

5. Адсорбция на носителе с последующей попе­речной «сшивкой». Этот способ сочетает в себе способы 1 и 4.

По сравнению с обычной адсорбцией на носителе получается более глубокий слой молекул фермента, доступных для субстрата и продукта, а по сравнению с обычной «сшивкой» – более проч­ная гранула, имеющая жесткий остов в центре (рис. 12.А).

6. Включение в полупроницаемые капсулы. Внутри капсулы (рис. 12.Б) как бы существует коллоидный ра­створ фермента. Внешняя оболочка капсулы довольно прочная, непроницаема для фермента, но проницаема для продукта и суб­страта.

А Б

Рис. 12. Иммобилизация фермента методом адсорбции на носителе с последующей поперечной «сшивкой» (А); методом включения в полупроницаемые капсулы: 1 – капсула с полупроницаемой стенкой; 2 – молекулы фермента, взвешенные в растворе внутри капсулы

7. Сополимеризация фермента и полимера-носителя. Напоминает включение в гель, но матрица создается путем сополимеризации полифункционального реагента и фер­мента (т.е. фермент не просто находится в «клетке» геля, но и сцеплен с ней). Этот способ является сочетанием способов 2 и 4 (рис. 13).

Примером является широко распространенный полиакриламидный гель, в котором в качестве реагента используется глутаровый альдегид.

Рис. 13. Иммобилизация фермента

методом сополимеризации с полимером-носителем

8. Физическое смешение – перемешивание фермента и порошка носителя. Метод довольно прост, но не очень на­дежен. Фермент может отслаиваться от носители и переходить в раствор.

Во всех случаях иммобилизации допускается прикрепление фермента только с помощью функциональных групп, не входящих в активный центр фермента. Один и тот же фермент может быть иммобилизирован несколькими методами. Однако иммобилизация всегда связана с потерей части активности фермента, кроме того, частично нарушается свободный доступ фермента при его связывании. Но, несмотря на потерю от 10 до 90 % активности фермента при его иммобилизации и на уменьшение скорости течения реакции такие ферменты имеют технологические преимущества по сравнению с несвязанными. Их можно легко отделить от продуктов реакции и использовать многократно и фермент не загрязняет продукт. Кроме того, иммобилизованные ферменты более стабильны к действию температуры и рН среды. Так ферменты, которые в свободной форме инактивируются при 50 ºС мгновенно, после иммобилизации работают неделями и месяцами.

Сферы использования ферментов

В современной промышленности наибольшее значение имеют гидролитические ферменты. Они способны катализировать реакции без присутствия коферментов. В многих химических процессах гидролазы заменили процесс кислотного гидролиза. С их помощью получают вещества без ущерба для вкуса и аромата продукта.

Кроме того, по внешнему проявлению действия различают несколько групп ферментов, большинство из которых входит в группу гидролаз:

К амилолитическим ферментам относятся α-амилаза, β-амилаза, глю-коамилаза. Их действие проявляется при гидролизе крахмала и гликогена. Крах­мал при гидролизе сначала расщепляется на более простые полисахариды – дек­стрины, а затем – до глюкозы.

α-амилаза гидролизует любые а-1,4-глюкановые связи (амилаза, амило-пектин, гликоген); β-амилаза – фермент концевого действия, последовательно отщепляет остатки дисахарида мальтозы от концов цепей. Глюкоамилаза гидро­лизует крахмал с образованием глюкозы и небольшого количества декстринов. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.

Протеолитические ферменты относятся к гидролазам, образуя группу пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность – выборочный, селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин – только на связь между аргинином и лизином. Из них рН 1,5-3,7 имеют кислые протеазы; рН 6,5-7,5 – протеазы; рН> 8,0 – щелочные протеазы.

Применение протеаз широкое: мясная промышленность для умягчения мя­са, кожевенная промышленность – при обезволошивании (удаление волосяного покрова) и мягчении шкур; кинопроизводство – для растворения желатинового слоя на пленках при их регенерации; парфюмерия – при создании добавок в зуб­ную пасту, кремы, лосьоны, промышленность синтетических моющих средств – при применении моющих добавок для удаления загрязнений белковой природы; медицина – при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов.

Пектолитические ферменты объединены в одну группу по внешнему проявлению своего действия – уменьшению молекулярной массы и снижению вязкости пектиновых веществ (пектин – пектиновые кислоты и протопектин) представителей полисахаридов. Они содержатся во фруктах, корнеплодах, стеб­лях (лен). Пектиновые вещества имеют молекулярную массу от 20000 до 200000. Все пектиназы делятся на два вида – гидролазы и трансэлиминазы. Первые от­щепляют метильные остатки (пектинэстеразы) или разрывают α-1.4-гликозидные связи (полигалактуроназы). Вторые ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применение в текстильной промышленности – вымачивание льна перед его переработкой, в виноделии – осветление вин, уничтожение мутности, в консервировании – при приготовлении фруктовых соков.

Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется лишь в деполимеризации молекул целлюлозы, обычно они действуют в виде комплекса, который в целом доводит гидролиз целлюлозы до глюкозы. Использование их очень перспективно в гидролизной промышленности – это получение глюкозы из целлюлозы; в медицинской – выделение лекарственных веществ (стероидов) из растений; в пищевой – улучшеие качества растительных масел; в сельском хозяйстве – как добавки в комбикорма для жвачных животных.

В мире производится около 530 т протеаз, 350 т глюкоамилазы, 350 т α-амилазы, 70 т глюкозоизомеразы.

3.2. Биотехнология молочных продуктов

Микробиология кисломолочных продуктов. Кисломолочные продукты (сметана, творог, простокваша, кефир, кумыс и др.) имеют высокую усвояемость, повышен­ную стойкость. Они имеют высокие вкусовые качес­тва и обладают лечебными свойствами, быстрее, по сравнению с цельным молоком, подавляют развитие гнилостной микроф­лоры. В 1 мл кисломолочного продукта содержится до 1-2 млрд. клеток микро­бов.

Кисломолочные продукты, приготовленные на заквас­ках мезофильных молочнокислых бактерий (простокваша обыкновенная, творог и сметана).

Для получения обыкновенной простокваши молоко, пас­теризованное при 85-90°С в течение 10-15 мин. и охлажденное до 30°С, заквашивают 5% закваски, содержащей чистые куль­туры мезофильных молочнокислых стрептококков (Str.lactis, Str.cremoris) и ароматообразующие бактерии. При этих усло­виях молоко сквашивается через 6-8 ч.; после образования сгустка простоквашу (при кислотности не ниже 75°Т) направ­ляют в помещение с температурой близкой к 0°С (но не выше 8°С) для набухания белков. Готовая простокваша имеет ров­ный сгусток и слабокислый вкус (кислотность 85-110°Т).

Для приготовления творога и сметаны применяют ту же закваску, что и для простокваши обыкновенной (т.е. смесь мезофильных молочнокислых стрептококков). Отличие в сво­йствах молочнокислых стрептококков заключается в том, что для приготовления сметаны, используют расы Str.lactis, обра­зующие вязкую сметанообразную консистенцию, тогда как для приготовления простокваши и творога применяют расы, образующие при сквашивании молока ровный плотный сгус­ток. Для улучшения вкуса и аромата в закваску вводят ароматообразующие бактерии. Использование при выработке тво­рога заквасок мезофильных и термофильных молочнокислых стрептококков (в соотношении 1:1) позволяет при повышен­ной температуре сквашивания (38-40°С) значительно сокра­тить продолжительность технологического процесса.

Кефир приготовляют на естественной закваске – кефир­ных грибках, представляющих собой симбиоз различных микроорганизмов. Куда, кроме мезофильных молочнокислых палочек (бета бактерий и стрептобактерий) и дрожжей, входят молочнокислые стрептококки и уксуснокислые бактерии.

В процессе приготовления кефира происходит молочнокислое и спиртовое брожение: первое вызывается мезофильными молочнокислыми стрептококками и палочками, второе – дрожжами и в меньшей степени ароматообразующими бактериями.

Для приготовления кефира закваску вносят в сквашенное молоко в количестве 5% объема. Сквашивание кефира правильнее вести при пониженной температуре (20-22°С или ниже). Более высо­кая температура (28-30°С) приводит к вытеснению молочно­кислыми стрептококками молочнокислых палочек и дрожжей.

Большое влияние на спиртовое брожение в кефире оказы­вает температура его созревания (лучше 10-12°С). При этой температуре дрожжи развиваются в достаточном количестве, а молочнокислое брожение резко замедляется.

В зависимости от длительности созревания различают сла­бый (однодневный), средний (двухдневный) и крепкий (трехдневный) кефир.

В слабом кефире кислотность 90°Т, содержание спирта 0,2%; в среднем – соответственно 105°Т и 0,4%; в крепком – 120°Т и 0,6%.

Для приготовления кефира на чистых культурах использу­ют закваску: молочнокислые стрептококки (Str.lactis, Str.cremoris) и ароматобразующие бактерии, молочнокислые па­лочки (бета-бактерии и стрептобактерии), дрожжи, сбражива­ющие молочный сахар.

Кисломолочные продукты, приготовленные на заквасках термофильных молочнокислых бактерий.

Болгарская простокваша (йогурт) является кисломолочным продуктом, широко распростра­ненным в Болгарии, Греции, Турции; близким к ней по спосо­бу приготовления являются южная простокваша, мацун (Армения), мацони (Грузия), даги (Индия).

Болгарскую простоквашу готовят из молока, пастеризо­ванного при температуре 85-90°С. Если пастеризацию прово­дят с выдержкой, то получают продукт с более плотной кон­систенцией.

При заквашивании молока 5 % закваски, содержащей смесь термофильного стрептококка и болгарской палочки, свер­тывание наступает через 2,5-3 ч. (при температуре сквашива­ния 40-42°С). Готовая простокваша после охлаждения имеет плотный сгусток и сметанообразную консистенцию; вкус – чистый, кисловатый.

Положительным свойством болгарской простокваши явля­ется ее способность удерживать сыворотку даже при длитель­ном хранении.

Приготовление простокваши с использованием термо­фильных молочнокислых бактерий, помимо улучшения вкуса продукта, значительно ускоряет процесс сквашивания (до 2,5-3 ч. вместо 5-6 ч. при сквашивании обычным методом).

Одной из разновидностей йогурта является биогурт, в со­став закваски которого входит ацидофильная палочка и Str.lactis, выделенный из норвежского кислого молока тэтте.

Кисломолочный напиток «Снежок». Состав микрофлоры этого кисломолочного напитка сходен с микрофлорой болгарской простокваши. Для его приготовле­ния в молоко вносят 7 % сахара; смесь пастеризуют при темпе­ратуре 85-92°С, гомогенизируют под избыточным давлением 175 атм. и выдерживают 10 мин.

Далее смесь охлаждают (летом – до 42-45°С, зимой – до 50°С) и заквашивают 5 % закваски (4 % термофильного стрепто­кокка и 1 % болгарской палочки). Сквашивание молока продолжается обычно не более 2,5-3 ч., кислотность готового продукта не должна превышать 80°Т. Сгусток размешивают и охлаждают до 8-10°С, добавляют фруктовый сироп. После это­го напиток снова размешивают и разливают в бутылки.

Ацидофильная простокваша. Продукт очень близкий к болгарской простокваше и отли­чается тем, что в состав закваски вводят ацидофильную палоч­ку вместо болгарской. Ацидофильная палочка обладает большой способностью приживаться в кишечнике, и ее применяют при изго­товлении диетических кисломолочных продуктов.

Кумыс является диетическим кисломолочным напитком, приго­товленным из молока кобылиц.

При сквашивании молока кобылиц казеин выпадает в виде мелких хлопьев, почти не ощутимых на языке и практически не меняющих консистенцию напитка. Как и кефир, кумыс яв­ляется продуктом комбинированного брожения – молочно­кислого и спиртового. Однако, если в кефире основным явля­ется молочнокислое брожение, то в кумысе оно играет второстепенную роль, а главную – спиртовое брожение.

Основную микрофлору кумыса составляют термофильные молочнокислые палочки, близкие к Lactobact. bulgaricum. Другим элементом микрофлоры кумыса являются дрожжи.

По кислотности и содержанию спирта кумыс разделяют на три вида: слабый с кислотностью 60-80 ºТ и содержание спирта до 1,0 %; средний с 81-105 ºТ и до 1,75 %, а также крепкий с 106-120 ºТ и до 2,5 % соответственно.

Биотехнология масла

Жизнедеятельность микроорганизмов протекает преимущественно в плазме мас­ла, которая представляет собой водный раствор белков, молочного сахара, молочной кислоты (в кислосливочном мас­ле), солей и других веществ.

Плазма находится в масле в виде капель различной ве­личины, частично соединенных между собой тончайшими ка­пиллярами. В 1 г масла содержится около 10-18 млн. капель влаги. При сбивании масла большая часть микроорганизмов переходит в пахту. В 1 мл сливок с 10 % закваски содержится 278 млн. бактерий, в 1 мл масла – 4,1 млн. и в 1 мл пахты – 336 млн. (Гримес).

Микроорганизмы в сладкосливочном масле играют чаще всего отрицательную роль (только некоторые виды дрожжей способствуют повышению стойкости масла при хранении). В кислосливочном масле роль молочнокислых бактерий по­ложительная. Они способствуют созданию в нем специфичес­кого вкуса и аромата и повышают его стойкость (образовавша­яся молочная кислота подавляет гнилостные бактерии).

Сырьевой основой для производства масла являются молочные сливки. При выработке кисломолочного масла основную микрофлору сливок состав­ляют молочнокислые стрептококки (Str. lactis, Str. cremoris) и ароматообразующие бактерии.

Изменение микрофлоры масла при его хранении

Сладкосливочное масло в зависимости от температуры хра­нения характеризуется следующим составом микрофлоры: при низкой положительной температуре в значительном количестве находятся посторонние (немолочнокислые) мик­роорганизмы (микрококки, споровые и бесспоровые палочки, дрожжи и др.); при повышенной температуре хранения пре­обладают молочнокислые бактерии.

Основной микрофлорой свежего кислосливочного масла длительного сквашивания являются молочнокислые стрептококки. После месячного хранения происходит незначительное увеличение посторонней микрофлоры.

В масле краткого сквашивания – сладкосливочном (при несколько более низкой кислотности плазмы) в начале хранения основную микрофло­ру составляют молочнокислые бактерии, но в процессе хране­ния наблюдается более сильное, чем в масле длительного сква­шивания, развитие посторонних бактерий.

В длительно хранившемся масле наблюдается повышенное количество дрожжей. Чаще всего встречаются виды, не­сбраживающие молочный сахар, медленно развивающиеся в масле. Дрожжи, сбраживающие молочный сахар, преоблада­ют в свежем масле, но в процессе его хранения они быстро от­мирают.

Повышение стойкости масла

Повышать стойкость масла при хранении можно путем использования бесспоровых дрожжей (род Тоrulopsis). Они не сбраживают лактозу и другие сахара – по типу спиртового брожения; не вызывают разложения белков и жира. Используют виды, быстро развивающиеся на по­верхности, и другие – во внутренних слоях монолита. Первые подавляют рост плесневых грибов на поверхности, другие задерживают окислительные процессы внутри моно­лита масла.

Биотехнология сыров

Микробиологическая сущность сыроделия. Процесс сыропроизводства включает в себя следующие операции: образование казеинового сгустка и его обработку, прессование и придание сырной массе определенной формы, посолку и созревание продукта. Для производства сыров испо­льзуют пастеризованное и сырое молоко. Парное молоко непригодно. Во время пастеризации уничтожаются микроор­ганизмы, которые могут быть причиной вспучивания сыров и других пороков. Однако нагревание молока замедляет про­цесс свертывания, т.к. при этом происходит осаждение солей кальция.

Свертывание молока (метод получения белка в сыроделии) осуществляется с помощью молочнокислых микробов (при выработке кисломолочных сыров) и микробов в сочетании с сычужным ферментом (при выработке других видов сыров). Под действием микробов в сырной массе происходят сложные биохимические процессы: созревание, формирование органо-лептических и других свойств, характерных определенному виду сыра. Из пастеризованного молока сыр можно пригото­вить путем внесения чистых культур молочнокислых бакте­рий (закваски). Для каждого вида сыра должна быть своя закваска.

При выработке твердых сычужных сыров бактериальную закваску вносят в количестве 0,2-0,5 %, при изготовлении мяг­ких сыров – 3-5 %. В состав бактериальных заквасок входят кислотообразователи (Str. lactis и Str. cremoris), а также микро­бы, образующие кислоту и ароматические вещества (Str. dlacetilactis, Str. paracitrovorum).

В зависимости от режима технологии применяют также Lactobact. helviticum, Str. thermophilus и др., из антагонистов маслянокислых бацилл – Lactobact. plantarum.

Сычужный фермент получают из сычугов 2-3-недельных телят. Он представляет собой порошок, который вносят в мо­локо для получения сгустка (геля). Активность сычужного фермента должна быть 1:100000, т.е. при температуре 35°С в течение 40 мин. 1 г фермента должен свернуть 100000 г (100 кг) молока. В промышленности применяют более высокую кон­центрацию фермента 2,5:100000, т.е. 2,5 г на 100 кг молока. Оптимальная температура действия фермента 40-41°С, рН 6,2. Ускорение действия фермента происходит при добавлении на 100 кг молока 15-20 г хлорида кальция.

Сущность созревания сыров. Сычужный фермент вызывает начальное разложение бел­ков (до пептонов), а более глубокий распад (до аминокислот и аммиака) происходит под воздействием ферментов, выделяе­мых молочнокислыми бактериями.

Таблица 1 – Влияние сычужного фермента и микроорганизмов на созревание сыров

Виды сыров	В процессе созревания участвуют
Кисломолочные сыры (без созревания)	Молочнокислые бактерии
Сыры с низким вторым нагреванием (латвийский, голландский)	Сычужный фермент, мезофильные молочнокислые бактерии, микрофлора слизи (Bact. linens, микрококки, дрожжи)
Сыры с высоким вторым нагреванием (российский, швейцарский)	Сычужный фермент, мезофильные молочнокислые бактерии, пропионовокислые бактерии
Плесневые сыры:
закусочный	Сычужный фермент, мезофильные молочнокислые бактерии и плесневые грибы (Penic. candidum, Penic. camemberi) и бактерии красного цвета
рокфор	Сычужный фермент, мезофильные молочнокислые бактерии и плесневые грибы (Penic. roqueforti)

Степень разложения молочного сахара и казеина при со­зревании сыров неодинакова:

Молочный сахара →сбраживается полностью, казеин →пре­вращается в растворимое состояние: в твердых сырах – 1/3 часть, в мягких – почти весь.

Созревание полутвердых и твердых сыров протекает от внутренней части к поверхности. Мягкие сыры созревают от поверхности в глубину. В твердых сырах распад белков более глубокий, чем в мягких.

Сыры, созревающие при участии мезофильных молочнокислых бактерий.

Латвийский сыр и сыры голландского типа. Количество бактерий в 1 г сыров с низким вторым нагреванием уже в первые дни созревания достигает нескольких миллиардов (в латвийском – 8,8, в голландском – 3,5 млрд.).

Быстрый рост бактерий в сыре продолжается до тех пор, пока в нем есть молочный сахар; после его расходования (обычно через 5-7 дней) количество бактерий постепенно снижается.

В обоих сырах во время созрева­ния преобладают молочнокислые стрептококки, и лишь к кон­цу его усиливается развитие молочнокислых палочек, потребляющих продукты разложения белков.

На созревание латвийского сыра большое влияние оказыва­ет микрофлора слизи, находящейся на поверхности, в состав которой входят, кроме молочнокислых бактерий, дрожжи, микрококки, плесневые грибы, протеолитические бактерии (типа Васt. lines). В первые дни созревания сыра вследствие кислой реакции в слизи бурно развиваются дрож­жи и плесневые грибы, а затем, после установления нейтраль­ной реакции, усиливается развитие микрококков и протеолитических бактерий. Возможно, что это происходит не только из-за снижения кислотности, но и вследствие обогащения сре­ды ростовыми веществами и витаминами после отмирания и автолиза дрожжей. Протеолитические ферменты, накаплива­ющиеся в слизи, диффундируют во внутренние слои сыров, ускоряя процесс разложения белков. При этом в подкорковом слое белки разлагаются быстрее, чем в центральной части, что подтверждается более выраженным вкусом подкоркового слоя сыра.

Чеддар. Температура второго нагревания, приме­няемая при его выработке, обычно не превышает 40-45°С, что способствует быстрому размножению молочнокислых бакте­рий. Второй особенностью, еще в большей степени спосо­бствующей усиленному размножению молочнокислых бакте­рий является чеддаризация сырного пласта (выдерживание в течение нескольких часов до нарастания необходимой кислот­ности). Все это создает специфический (кисловатый) вкусовой букет сыра чеддар.

В первые дни созревания чеддара преобладают мо­лочнокислые стрептококки; количество их в 1 г сыра достигает миллиардов, после чего наступает постепенное вымирание, продолжающееся до конца созревания.

Развитие молочнокислых палочек протекает по-иному: в процессе созревания проис­ходит постепенное увеличение их количества. Основная роль среди мезофильных молочно­кислых палочек в процессе созревания чеддара принадлежит стрептобактериям (Lactob. plantarium).

По интенсивности распада белков чеддар близок к швей­царскому сыру.

Сыры, созревающие при участии термофильных молочнокислых бактерий.

Основное отличие российского и швейцарского сыров заключа­ется в высокой температуре второго нагревания, которая вызыва­ет резкое подавление размножения и даже частичную гибель мо­лочнокислых стрептококков, несколько замедляя в то же время и темп развития термофильных молочнокислых палочек.

Охлаждение этих сыров вследствие их большого размера происходит медленно. Выдерживание в бродильном подвале (температура выдержки российского сыра 20-25°С, швейцарско­го – 18-25°С) также способствует сохранению повышенной температуры внутри сыров. В результате этого в российском и швейцарском сырах обильно развиваются термофильные мо­лочнокислые палочки.

По количеству бактерий, действующих в процессе созревания, и скорости их раз­множения эти сыры значительно уступают латвийскому и гол­ландскому.

При изучении динамики микробиологических процессов при выработке и созревании швейцарского сыра уста­новлены следующие изменения в составе его микрофлоры. Количество мезофильных молочнокислых бактерий (стрепто­кокков и палочек) увеличивается в начале выработки, а при втором нагревании вследствие высокой температуры снижает­ся до 10% от начального количества. При прессовании коли­чество их вновь возрастает, достигает максимума (свыше 1 млрд. в 1 г), а затем постепенно снижается.

Количество молочнокислых стрептококков в первые дни созревания повышается параллельно с увеличением количес­тва молочнокислых бактерий. В последующем ускоряется вы­мирание молочнокислых стрептококков.

На развитие термофильных молочнокислых стрептококков второе нагревание оказывает меньшее влияние: рост их про­должается при прессовании. При посолке отмечается сниже­ние роста, но при выдержке сыров в бродильном подвале ко­личество термофильных стрептококков вновь увеличивается.

Мезофильные молочнокислые палочки (стрептобактерии) при выработке сырной массы вследствие своей малой актив­ности развиваются слабо. В начале созревания количество их постепенно увеличивается и только через месяц несколько снижается. В течение последующего периода созревания сыра наблюдается незначительное их вымирание, однако и при этом их количество превышает число молочнокислых бакте­рий. Это указывает на большую роль стрептобактерий в про­цессе созревания швейцарского сыра.

Пропионовокислые бактерии размножаются в сыре в значительном количестве в период выдерживания его в бро­дильном подвале. Рост их продолжается в течение всего перио­да созревания. В результате пропионовокислого брожения в сыре образуются специфический вкус и запах швейцарского сыра, а также характерный рисунок (крупные «пузырьки»).

В российском сыре вследствие более низкой температуры второго нагревания (50-54°С) и большего содержания влаги микробиологические процессы протекают энергичнее, чем в швейцарском. Поэтому российский сыр созревает быстрее швейцарского: если для созревания последнего требуется око­ло 7-9 месяцев, то в российском сыре этот процесс заканчивается через 4 месяца.

Плесневые сыры. Плесневые сыры обладают специфическим вкусом и запа­хом, отличающимися от вкуса и запаха сыров других видов. Своеобразие вкуса обусловлено разложением не только мо­лочного сахара и белков, но и жира. Жир разлагается плесне­выми грибами, специально вносимыми при выработке этих сыров.

Плесневые грибы для закусочного сыра выращивают на пшеничном хлебе, для рокфора – на ржаном.

Закусочный сыр. Микробиологические процессы при созревании закусочно­го сыра протекают очень интенсивно, вследствие чего созрева­ние заканчивается в течение месяца.

В качестве специальных культур применяют (путем опрыскивания поверхности) Реnicillum candidum с бесцветны­ми спорами и Реnicillum camemberti , имеющих слегка окрашен­ные споры. Колонии у первого гриба белого цвета, у второго – споры вначале также белого цвета, но с возрастом приобрета­ют слегка голубоватый, затем кремовый оттенок.

Во внутренних слоях сыра вначале происходит бурное раз­множение молочнокислых стрептококков, количество которых уже в первые дни созревания достигают максимума (около 6,5 млрд. в 1 г), затем наступает резкое вымирание, и приблизи­тельно через 10 дней количество их постепенно снижается до сотен миллионов. В за­кусочном сыре молочнокислые палочки размножаются значи­тельно интенсивнее, чем в латвийском и голландском. Через 15 дней их количество достигает нескольких млрд. в 1 г.

На поверхности закусочного сыра с первых дней наблюда­ется пышное развитие дрожжеподобного грибка рода Саndida. Позднее развиваются плесневые грибы, которыми специ­ально обсеменяется поверхность сыра: иногда наблюдается развитие обычных плесневых грибов (Реnicillum glaucum, Еndomices lactis).

Саndida и плесневые грибы обладают сильными протеолитическими свойствами. Разлагая казеин, они нейтрализуют кислоту на поверхности сыра, создавая благоприятные усло­вия для развития аэробных щелочеобразующих бактерий.

Рокфор. Рокфор вырабатывают из овечьего и коровьего молока. В процессе созревания, кроме молочнокислых бактерий, участвует специально добавленный плесневый грибок Реnicillum roqueforti, близкий к обычному плесневому грибу зеленого цвета (Реnicillum glaucum).

Споры плесневого гриба вносятся путем послойного обсеменения сырного зерна при формовании.

По характеру развития микрофлоры рокфор приближает­ся к закусочному сыру. Наибольшее количество бактерий (около 5,5 млрд. в 1 г) наблюдается в первые дни созревания: к 15-му дню, как и в закусочном сыре, количество бактерий рез­ко снижается, достигая сотен миллионов в 1 г. После этого на­ступает медленное затухание бактериальных процессов.

Созревание рокфора в первые дни протекает главным обра­зом под воздействием ферментов молочнокислых стрепто­кокков: после 10 дней в этом процессе принимают участие мо­лочнокислые палочки (из группы стрептобактерий), количес­тво которых в этот период даже превышает количество мо­лочнокислых стрептококков. Такое быстрое их размножение обусловлено, по всей вероятности, развитием плесневого гри­ба внутри сыра. Помимо разложения жира, плесневые грибы разлагают белки, снижая тем самым кислотность сыра. Пос­леднее способствует усиленному размножению молочнокис­лых палочек в первый период созревания, что характерно для сыров с низким вторым нагреванием.

Специфический первичный вкус рокфора обуславливается накоплением летучих жирных кис­лот (капроновой, каприловой и их солей) и образующихся из них метилкетонов. Сыры с нормальным развитием повер­хностной микрофлоры содержат больше летучих кислот и аминного азота, имеют более чистый вкус и лучшую консис­тенцию по сравнению с теми сырами, на поверхности которых наблюдалось недостаточное развитие микрофлоры.

Ускорение созревания сыров

Для ускорения созревания сыров предложено (Альтмери) применять концентрированный фермент молочнокислых бактерий (ацидофермент). Сущность метода заключается в получении автолизатов, содержащих ферменты различных видов молочнокислых бактерий. При ускорении процесса со­зревания должен сохраняться типичный вкусовой букет сыра данного вида. В состав препаратов должны входить ферменты тех молочнокислых бактерий, которые принимают участие в созревании того или иного вида сыра.

При получении ферментов для сыров с низким вторым нагреванием необходимо использовать мезофильные мо­лочнокислые стрептококки (Str. lactis и Str. cremoris), ароматообразующие бактерии и молочнокислые палочки (стрепто­бактерии). Для сыров с высоким вторым нагреванием следует применять препарат ферментов, полученных из культур термофильных молочнокислых стрептококков (Str. thermophilus) и палочек (Lactob. helveticum).

Ускорение созревания сыров должно осуществляться путем создания благоприятных условий для развития молочнокис­лых бактерий и более длительного сохранения их в активном состоянии. Для этого можно применять «гидролизованную» закваску. Сущность данного метода за­ключается в том, что в молоко для приготовления закваски вносят одновременно сычужный фермент и чистые культуры молочнокислых бактерий; под действием сычужного фермен­та в закваске усиливается накопление растворимых форм бел­ков. Последнее усиливает размножение молочнокислых бакте­рий не только в закваске, но и в самом сыре, т.к. при внесении ее в молоко сыр уже в свежем состоянии будет содержать боль­ше растворимых азотистых соединений.

Для активирования молочнокислых бактерий можно вносить в молоко, идущее на выработку сыров, культуры дрожжей, не сбраживающих молочный сахар.

Биотехнология молочных консервов и мороженого

При производстве молочных консервов и мороженого приме­няют следующие способы борьбы с микроорганизмами (уничто­жения, прекращения или замедления их размножения):

• тепловая обработка (115-118°С) при производстве сгущенного стерилизованного молока – уничтожение клеток микробов и их спор;

• удаление влаги при производстве сухого молока – вызы­вает явление плазмолиза в клетках и прекращает их развитие;

• добавление сахара при производстве молока с сахаром – оказывает действие, сходное с высушиванием, но более слабое; некоторые микроорганизмы, хотя и очень медлен­но, размножаются при хранении этого продукта;

• воздействие на продукт отрицательной температуры (-18°С) при производстве мороженого прекращает разви­тие микроорганизмов.

Микробиологические процессы в молочных консервах играют только отрицательную роль, поэтому условия выра­ботки данных продуктов должны способствовать или полному уничтожению микроорганизмов (сгущенное стерилизованное молоко), или прекращению развития в процессе хранения (сгущенное молоко с сахаром, сухое молоко).

Сгущенное стерилизованное молоко. В производственных усло­виях применяют термическую обработку сгущенного в 2-2,5 раза молока при темпе­ратуре 115-118°С в течение 15 мин.

Возбудителями пороков являются главным образом споровые палочки, которые могут выдерживать высокую тем­пературу. Свертывание молока чаще всего вызывают споро­вые аэробные бактерии (Васillus coagulans, Bacillus cereus). Бом­баж вызывают анаэробные споровые бактерии, обладающие способностью сбраживать молочный сахар с образованием газа, вызывающие глубокое разложение белков маслянокислые бактерии (Сlostridium amylobacter) и гнилостные анаэроб­ные бактерии (Сlostridium putrificus). При гнилостном разложе­нии белка сгусток молока оседает на дно, сверху остается мутная сыворотка. При образовании газа сгусток плавает на поверхности сыворотки. В некоторых случаях молоко приоб­ретает гнилостный запах (при этом сгусток полностью разла­гается).

Сгущенное молоко с сахаром. Стойкость данных молочных консервов достигается не стерилизацией, а добавлением сахарозы (в количестве 18 % по отношению к сырому молоку). При таком количестве сахара подавляется жизнедеятельность большей части микрофлоры молока, а, следовательно, значительно повышается стойкость хранении.

Ухудшают качество сгущенного молока с сахаром шоколадно-коричне-вая плесень и цветные микрококки. Они вызывают появление в молоке сырного вкуса. Источником обсеменения продукта этими микроорганизмами являлся сахар.

Сухое молоко. Сухое молоко является наиболее стойким молочным продуктом. В нем содержится не более 7 % влаги (в негерметич­ной упаковке). При этих условиях микроорганизмы не могут размножаться, и изменения качества, которые наблюдаются при хранении сухого молока, происходят под воздействием главным образом физико-химических факторов (свет, повы­шенная влажность и др.).

Сухое молоко получают пленочным и распылительным способами. При пленочном способе применяется более высо­кая температура (около 100°С), в результате чего в молоке со­храняется значительно меньше микробов (споры бактерий), чем при распыли­тельном способе сушки при температуре 65-70°С (кроме споровых бактерий, содержатся микрококки, молочнокислые бактерии и др.).

Чем меньше влаги в сухом мо­локе, тем лучше сохраняются его первоначальные свойства.

Общее количество бактерий в 1 г сухого молока (распыли­тельного и пленочного) допускается: не более 50000 – для мо­лока высшего сорта и 100000 – для первого сорта. Содержание патогенных бактерий и кишечной палочки не допускается.

Мороженое. Смесь, из которой вырабатывают мороженое, составляют из молочных продуктов (цельное, сгущенное и сухое молоко, сливки и масло), желатины или агара, сахара, изюма, яиц (или меланжа), кофе, какао, шоколада, миндаля, орехов, ванилина, крахмала и др. Основными источниками микрофлоры явля­ются молоко и молочные продукты, а также яйца (особенно меланж), где могут присутствовать сальмонеллы и b-гемолитические стрептококки. Орехи часто заражены дрожжами и плесневыми грибами.

В процессе охлаждения смеси вследствие его непродолжи­тельности количество бактерий обычно не увеличивается.

Совершенствование технологии и улучшение санитарных условий производства мороженого способствуют снижению его бактериальной обсеменености. Бактерии бруцеллеза могут сохраняться в мороженом при температуре -23ºС свыше 7 лет, бактерии туберкулеза – в течение 6,5 лет, бактерии брюшного тифа – при температуре -12…-22ºС сохраняются в течение 2,5 лет.

3.3. Биотехнология мясных продуктов

Изменение микрофлоры мяса и мясопродуктов при их хранении и посоле. Мясо и мясопродукты являются хорошей питательной сре­дой для развития микроорганизмов. Поэтому в целях сохране­ния качества мяса и мясопродуктов их подвергают посолу, хо­лодильному хранению и другим видам консервирования.

Изменение микрофлоры мяса при холодильном хранении

Микрофлора охлажденного мяса. В камерах охлаждения температуру перед загрузкой мяса поддерживают от -1 до -3°С, а во время охлаждения – от -1 до 0°С. Относительная влажность воздуха в начале охлаждения 95-98 %, а после окон­чания загрузки и до конца охлаждения – 90-92 %. Во время охлаждения испаряется влага, и температура мяса (туши) сни­жается. К концу процесса охлаждения температура в мясной туше (в ее глубоких слоях) становится близкой к температуре воздуха в камере. Поверхностный слой туши подсыхает, образующаяся корочка препятствует росту микрофло­ры и проникновению ее вглубь тканей туши.

Микрофлора мяса, поступающего на хранение в камеры охлаждения, разнообразна по составу и обычно представлена мезофилами, термофилами и психрофилами, т.е. микро­организмами, имеющими неодинаковые температурные пределы роста.

К концу охлаждения в глубоких слоях мяса температура должна достигать 0-4°С. Следовательно, на охлажденном мясе в процессе хранения могут развиваться только психрофильные микроорганизмы.

Термофильные и большинство мезофильных микроорга­низмов, которые не развиваются при температурах, близких к 0°С, после охлаждения мяса полностью приостанавливают свою жизнедеятельность, переходя в анабиоз. В процессе по­следующего хранения продукта эти микроорганизмы посте­пенно отмирают. Но некоторые патогенные и токсигенные бактерии из группы мезофилов (сальмонеллы, стафилококки и др.) длительное время сохраняют жизнеспособность при низких температурах и не отмирают при хранении охлажден­ного мяса.

Размножение микроорганизмов в мясе при низких темпера­турах проходит несколько фаз (лаг-фазу, логарифмическую, максимальную стационарную и фазу отмирания). В началь­ный период хранения охлажденного мяса психрофилъные микрорганизмы, находясь в лаг-фазе (фазе задержки роста), некоторое время не размножаются или размножаются незначительно.

При соблюдении установленного температурно-влажностного режима (относительная влажность 85-90 %, температура воздуха от -1 до 1°С) на охлажденном мясе, полученном в результате убоя здоровых животных, размножение микроорганизмов задерживается на 3-5 дней и более.

По истечении лаг-фазы начинают усиленно размножаться психрофильные микроорганизмы (логарифмическая фаза), и их число резко возрастает. При этом первое место из психрофильных неспорообразующих форм микроорганизмов зани­мают бактерии, относящиеся к группам Pseudomonas и Achromobacter. В значительно меньшем количестве встречаются Flavobacterium, реже и в небольшом количестве – Alcaigenes, Аerobacterium и некоторые микрококки.

Вначале эти микроорганизмы размножаются на более влаж­ных местах туши, образуя отдельные колонии, а затем они сли­ваются в виде сплошного мажущегося слизисто-мутного серого налета. Количество бактерий на мясе к моменту появления сли­зи, по различным источникам, колеблется от 3 млн. до 32-50 млн. на 1 см². На мясе, покрытом толстой пленкой слизи, количество бактерий достигает 10⁹-10¹⁰ на 1 см². При хранении мяса в условиях температуры выше 5°С в образовавшейся слизи, помимо микробов группы Pseudomonas и Achromobacter, встречаются дрожжевые клетки, актиномицеты, палочка протея, микрококки и др.

При длительном хранении мяса в охлажденном состоянии некоторые виды бактерий группы Pseudomonas образуют слизь зеленоватого или бурого цвета. Такая же окраска придается и продукту. Во время роста бактерий из группы Pseudomonas и Achromobacter используют большое количество кислорода, вследствие чего ощущается недостаток кислорода на повер­хности туши, что способствует потемнению мяса. Изменение окраски мяса может быть вызвано также окислением гемогло­бина мышц до метгемоглобина.

Перечисленные изменения снижают товарный вид мяса, но не являются вредными для здоровья человека и незначительно влияют на вкусовые свойства продукта.

Психрофильные микроорганизмы, способные активно раз­множаться, со временем становятся преобладающими в соста­ве микрофлоры продуктов, хранящихся в данных условиях.

В условиях, неблагоприятных для развития психрофиль­ных аэробных бактерий (пониженная влажность и более низ­кая температура хранения), наблюдается активный рост плес­невых грибов и аэробных дрожжей, которые имеют более низкие температурные пределы роста и менее требовательны к влажности.

Из плесневых грибов находятся представители из рода Penicillum, Мuсоr, Аspergillum, Сladosporium и Тhamnidium. Из дрожжей встречаются преимущественно розовые дрожжи (Rhodotorula). Гриб из рода Тhamnidium вызывает образование неприятного запаха. Плесень Сladosporium gerbarum при разви­тии на мясе глубоко проникает в мышечную ткань туши, а во время удаления этой плесени с туши приходится срезать верхний слой мяса.

Гриб из рода Тhamnidium и Сladosporium gerbarum считается основным возбудителем порчи мяса в условиях хранения при температуре -4… -9°С, т.е. когда рост других плесневых грибов сильно задерживается. Причиной неприятного землистого запаха могут быть развивающиеся на мясе актиномицеты.

Помимо пороков (ослизнение, плесневение, появление постороннего запаха) на охлажденном мясе в мышцах около кости, в области бедра, иногда обнаруживается запах закисания. Это обусловливается размножением бактерий в анаэроб­ных условиях в результате медленного охлаждения мяса.

Охлажденное при 0°С мясо обычно хранится не более 2-3 недель, что не позволяет перевозить мясное сырье на далекие расстояния.

Для предотвращения быстрой порчи мяса проводятся испытания по обработке его ионизирующим об­лучением. При соответствующих дозах достигается значитель­ная задержка размножения микроорганизмов. Но пока не по­лучено данных, которые можно было бы рекомендовать для практического применения. Из всех испытанных микроорга­низмов, наиболее чувствительными к ионизирующему облу­чению оказались бактерии из группы Pseudomonas. Доза в 100 тыс. рентген при облучении гамма-лучами (Со⁶⁰) вызвала ги­бель всех Pseudomonas на мясе; при этом мясо не имело особых изменений цвета, запаха или вкуса.

Углекислота также задерживает рост многих гнилостных бактерий, и применение ее целесообразно для удлинения сро­ков хранения мяса в охлажденном виде. Охлажденное мясо, хранившиеся в воздушной среде, содержащей 10% углекисло­ты, не подвергается порче в течение 60-70 дней (Загорянский). Продолжительность хранения мяса в охлажденном виде зави­сит от исходного содержания микроорганизмов на мясе, от температуры и влажности в камерах охлаждения.

При активном размножении микроорганизмов в результате их жизнедеятельности в конце стационарной фазы может наступить порча охлажденного мяса.

Микрофлора мороженого мяса. В случае необходимости длительного хранения мяса после охлаждения его заморажи­вают. При замораживании из мяса вымораживается вода, пре­вращаясь в кристаллы льда. Концентрация солей в мясе при этом увеличивается, а температура замораживания оставших­ся соков понижается.

Так может продолжаться до тех пор, пока концентрация солей мясного сока не достигнет состояния, при котором вода больше не замораживается, а оставшиеся растворы минеральных солей и белков превращаются в однородную твердую массу.

Мороженым считается мясо, когда в толстой части мышц бедра на глубине 8-10 см температура не превышает -6°С.

Во время замораживания мяса отмирает значительное ко­личество микроорганизмов, содержащихся в охлажденном мясе. Кроме низкой температуры на микроорганизмы губи­тельно действуют высокая концентрация растворенных в про­дукте веществ и пониженная влажность, создающиеся в ре­зультате вымерзания воды, изменение содержащихся в клетках белков и механическое действие льда, образующегося вне клетки, а при быстром замораживании – и внутри клетки. Причем чем ниже температура (-18.. .-20°С) и выше скорость замораживания, тем больше погибает микро­организмов.

Среди неспорообразующих бактерий эн­терококки (фекальные стрептококки) и стафилококки более устойчивы к замораживанию чем другие виды. Наиболее устойчивы к действию низких температур плесневые грибы и дрожжи. Их грибница развивается примерно 3 месяца, споры – 4-5 месяцев. Причем чем выше влажность, температура и меньше движение воздуха, тем быстрее плесневые грибы развиваются.

В процессе хранения мороженого мяса отмирание микро­организмов, выживших при замораживании, замедляется. По­лного отмирания микроорганизмов в мороженом мясе не про­исходит. Большинство плесневых гри­бов и дрожжей на мороженом мясе при -18°С не погибают в те­чение 3 лет. При -15…-20°С токсигенные стафилококки сохра­няют жизнеспособность на мороженом мясе до 30 дней, а сальмонеллы – до 6 месяцев и более. При -20°С содержание кишечной палочки уменьшается только через 6 месяцев, а энтерококков – остается практически постоянным в течение 9 месяцев хранения мороженых продуктов.

Минимальная предельная температура роста психрофиль­ных микроорганизмов выше -10°С, поэтому при хранении мяса ниже этой температуры психрофилы, как и мезофиль­ные микроорганизмы, не размножаются, а частично отмира­ют. В соответствии с этим по действующей в нашей стране тех­нологической инструкции мороженое мясо рекомендуется хранить при -12°С и ниже, что позволяет сохранять его прак­тически неограниченное время без признаков порчи.

Дефростированное мясо. Мороженое мясо перед упот­реблением подвергается оттаиванию (дефростации). Процесс оттаивания считается законченным, когда температура в тол­ще мышц достигает 0°С. Размножение микробов на оттаянном мясе происходит быстрее, чем на мясе, не подвергавшемся за­мораживанию.

Микроорганизмы, выжившие в процессе хранения моро­женого мяса, при его оттаивании начинают размножаться, т.к. происходит выделение мышечного сока и увлажнение повер­хности мяса. Интенсивность размножения микроорганизмов во многом зависит от способа замораживания. При медленном неглубоком замораживании в мышечной ткани образуются крупные кристаллы льда, что обусловливает разрыв оболочек большого количества клеток мышечных волокон и выделение значительного количества мышечного сока. В результате быстрого глубокого замора­живании в мышечной ткани образуются мелкие кристаллы льда, которые не травмируют оболочек окружающих их кле­ток ткани. После оттаивания мышечный сок проникает обрат­но в мышечные волокна и почти не выделяется. На активность размножения микроорганизмов во время размораживания влияет также температура. Если размораживание проводят при повышенной температуре (20-25°С), то к тому времени, когда оттают глубинные участки мышечной ткани, на повер­хности туши происходит интенсивное размножение микро­бов. При медленном размораживании (низкой плюсовой тем­пературе 1-8°С и относительной влажности 75-90%) микроорганизмы размножаются на поверхности мясных туш менее активно.

Изменение микрофлоры мяса при посоле

При посоле под влиянием высокой концентрации хлорида натрия, пониженной температуры и антагонистических взаи­моотношений микроорганизмов различных видов резко изме­няется количественный и групповой состав микрофлоры мяса. Наиболее существенные изменения обусловлены воздей­ствием хлорида натрия. Он оказывает консервирующее дей­ствие, задерживая развитие многих микроорганизмов, что объясняется одновременным действием нескольких факторов:

• создаваемое солью высокое осмотическое давление вызывает обезвоживание тканей продукта. Вследствие об­езвоживания и проникновения хлорида натрия снижает­ся показатель σ_w (активность воды), в результате чего нормальная жизнедеятельность многих организмов невозможна;

• выделяемые из поваренной соли ионы хлора нарушают протеолитическую ферментативную деятельность микроорганизмов. Развитие Salmonella и Сl.botulinum прекращается при концентрации соли свыше 10 %. Сал-монеллезные бактерии отмирают при концентрации соли 19 % через 75-80 дней. Кокковые формы бактерий переносят концентрацию соли 15%. Стафилококки, вызы­вающие пищевые отравления, прекращают рост при кон­центрации 15-20 %, а при 20-25 % они отмирают. В результате плохой растворимости кислорода в рассоле со­здается низкая его концентрация, вследствие чего замед­ляется размножение аэробных микроорганизмов.

В мясе и рассоле могут содержаться микроорганизмы, имеющие различную чувствительность к хлориду натрия:

• несолелюбивые (негалофильные), которые размножают­ся при 1-2% и полностью прекращают свое развитие при 6-10% соли. К этой группе относят многие неспорообразующие грамотрицательные гнилостные бактерии, мно­гие патогенные и токсигенные микроорганизмы;

• солеустойчивые (солетолерантные) хорошо размно­жаются при небольших концентрациях (1-2 %), дают сла­бый рост в средах, содержащих до 6-8 % хлорида натрия, и длительное время сохраняют жизнеспособность при вы­соких его концентрациях. К ним относят многие гнилос­тные аэробные бациллы, анаэробные клостридии, кокки, некоторые молочнокислые и патогенные бактерии;

• солелюбивые (галофилы) бывают двух типов: облигатные и факультативные. Облигатные размножаются только при высоких концентрациях соли (от 12% и выше) и со­всем не растут на средах с низким содержанием хлорида натрия. Факультативные растут достаточно хорошо как при высоких концентрациях, так и в присутствии 1-2% соли. Галофилами являются многие плесени, некоторые дрожжи, многие пигментные микрококки, некоторые пигментные палочковидные бактерии и др.

Поскольку значительная часть микроорганизмов, содержа­щихся в рассоле, способна размножаться при высоких концен­трациях хлорида натрия, посол следует проводить при пони­женной температуре (не выше 3-5°С).

При посоле мяса и мясопродуктов в рассол вносят нитраты или нитриты, которые соединяются с красящим веществом мяса (миоглобином) и обусловливают красный цвет мяса. Оказывают ли нитраты или нитриты какое-либо действие на микробы – до настоящего времени точно не установлено. Однако при посоле без селитры наблюдается большой про­цент порчи продуктов.

Биотехнология колбасных изделий

Колбасные изделия представляют собой мясной продукт, который предназначен для употребления в пищу без до­полнительной термической обработки.

Обработку мяса для колбасы начинают с обвалки (отделение мышечной ткани от костей) и жиловки (разборки его по со­ртам). При этом количество микрофлоры в мясе резко повы­шается. Увеличение количества микробов в мясе во время его обвал­ки происходит не за счет размножения их, а за счет обсемене­ния мяса с рук рабочих, с инструментов и оборудования, ин­вентаря и из воздуха помещения.

После обвалки и жи­ловки мясо солят. При этом вместе с посолочной смесью, состоя­щей из соли и селитры, в мясо могут попадать микроорганизмы. Чаще всего среди этих микроорганизмов встречаются: Вас.subtilis, Вас.mesentericus, Рseudomonas fluorescens, пигментные кок­ки, актиномицеты, споры плесневых грибов, некоторые галофильные микроорганизмы и др. Многие из этих микроорганиз­мов обладают протеолитическими свойствами.

Посол производят при тем­пературе 2-4°С. Сроки посола – не более 1-3 суток для варе­ных и 5-10 суток – для сырокопченых колбас. При такой тем­пературе в мясе мезофильные микробы не размножаются.

При измельчении посоленного мяса на волчке и при обра­ботке фарша в смесительной машине может происходить раз­множение микробов, а при добавлении к нему шпика и спе­ций фарш дополнительно обсеменяется микроорганизмами. Быстрому увеличению количества микробов в фарше спосо­бствует повышение его температуры до 18-22°С при измельчении. При этом в 1 г фарша число микроорганизмов мо­жет достигать сотен, тысяч и более. Поэтому машины для измельчения мяса (волчки, куттеры) и фар­шемешалки перед работой проходят термообработку, а в фарш добавляют лед или холодную воду.

Шприцевание, или набивку оболочки фаршем нужно производить равномерно и плотно. При неплотной набивке (шприцевании) фарша внутри бато­на колбасы могут образовываться пустоты («фонари»), в кото­рых скапливается влага, и создаются благоприятные условия для размножения микроорганизмов. Источником микробного обсеменения фарша при набивке могут служить кол­басные оболочки, особенно естественные (мокросоленые, пресно-сухие). В мокросоленых кишечных оболочках обычно содержатся бактериум галофилум, различные виды микро­кокков, сарцины, аэробные бациллы, актиномицеты, плесне­вые грибы и другие, галофильные и солеустойчивые микроор­ганизмы. В пресно-сухих кишечных оболочках также часто находятся споровые аэробные гнилостные бациллы, актино­мицеты, споры плесневых грибов и различные кокковые бактерии. Санитарная обработка кишечных оболочек перед использованием (очистка, дезинфекция) резко снижает мик­робное загрязнение. Искусственные оболочки более гигие­ничны.

Батоны, набитые фаршем, подвергают осадке. Если во время осадки не нарушается технологический режим (температура не выше 2°С, относительная влажность 85-95% и продолжи­тельность не более 2-4 ч.), то количество микробов в батонах остается без изменения. После осадки проводят обжарку колбас и затем их варку.

Обжарка. Обжарке подвергают, за исключением ливерных, все варе­ные и полукопченые колбасы, сардельки и сосиски. Под де­йствием дыма с высокой температурой (80-110°С) в течение 0,5-2 ч. происходит подсушивание оболочки, и образуется су­хая тонкая пленка. Создаются неблагоприятные условия для развития микробов на поверхности колбас.

Варку колбас начинают при высокой температуре (85-90°С), постепенно снижая ее до 75-87°С.

Остаточная микрофлора колбасных изделий после варки состоит в основном из спорообразующих палочковидных сапрофитных аэробных и анаэробных бактерий и незначи­тельного количества неспорообразующих сапрофитных бак­терий, главным образом кокков. Количество неспорообразующих микробов в вареных колбасах большого диаметра составляет обычно не более 10-12%, в батонах небольшого диаметра – только 4-7%, а в со­сисках – всего 1-3% от общего числа микробов, выживших при варке.

Охлаждение. После варки колбасных изделий во избежание быстрого размножения в них остаточной микрофлоры и по­рчи их охлаждают под душем до температуры 30-35°С, а за­тем – в холодильной камере до 4°С.

Копчение и сушка. Групповой состав микрофлоры полу­копченых колбас после копчения и сушки почти не изменяет­ся. Общее количество микроорганизмов несколько уменьша­ется, поскольку часть микробов, выживших при варке, отмира­ет в процессе дополнительной обработки.

Общая микробная обсемененность (КОЕ) вареных и полукопченых колбас I и II сортов должна быть не выше 1000 и колбас III сорта – не выше 2000 микробных клеток в 1 г. В колбасах не должны содержаться патогенные и условно-патогенные мик­роорганизмы (кишечная палочка и палочка протея).

Сырокопченые и варено-копченые колбасные изделия готовят по особой технологии. При этом бактерицидными и бактериостатическими агентами являются соль, антисепти­ческие вещества коптильного дыма, которыми пропитывается продукт (формалин, фенол, альдегиды и др.).

Сырокопченые колбасы по сравнению с варено-копчеными и вареными значительно медленнее подвергаются порче. В них содержится меньше влаги (30-40%) и больше анти­септиков. При изготовлении сырокопченых колбас батоны их под­вергают длительной (5-7 суток) осадке, холодному копчению (при температуре 18-25°С) и сушке (до 1,5 мес.). Разновиднос­тью сырокопченых колбас являются сыровяленые (вяленые) колбасы, которые после осадки сушат без предварительного копчения (вяление).

В начальных стади­ях технологического процесса в сырокопченой колбасе чаще обнаруживают: из спорообразующих видов – Вас. subtilius, Вас.mesentericus, реже – Bас.megatherium и В.mycoides; из гра-мотрицательных видов – Васt.faecalis alcaligenes, Е. соli citrovorum, Е. соli, Рroteus vulgaris, реже – Е.aquatilis communis, Васt.cloacae и Васt.morgani. В готовой, хорошо созревшей сыро­копченой колбасе встречаются совершенно другие микроор­ганизмы. Из кокковых форм чаще обнаруживают: Мicr. aquatilis, Str.cereus albus, Micr. pellicidum, Мicr.casei amori, Sarcine aurantiaca, реже – Мicr. Tetragenes tartissirnus, Мicr. chersonesia, Мicr. coralloides; из молочнокислых бактерий – Str. lactis и Еnterococci, lactobacterium plantarum.

Обычно в конце созревания сырокопченых и вяленых кол­бас молочнокислые бактерии и микрококки составляют наибольшую часть от общего количества микрофлоры про­дукта. Грамотрицательные бактерии, преобладающие в начальный период процесса, по мере созревания колбас посте­пенно отмирают; бактерии рода протеус отмирают и не обна­руживаются в фарше примерно к 18-30 дню, а кишечная па­лочка – через 30-50 дней сушки. В готовых созревших колбасах эти микроорганизмы, как правило, от­сутствуют.

Изменение состава микрофлоры сырокопченых и вяленых колбас связано с тем, что на состав и развитие микроорганиз­мов воздействуют такие факторы, как обезвоживание среды, повышение концентрации соли и связанное с ними снижение активности воды, применение коптильных веществ (на повер­хностную микрофлору сырокопченых колбас), изменение рН продукта и микробный антагонизм.

В процессе копчения продукт пропитывается антисеп­тическими веществами коптильного дыма, подавляющими развитие неспорообразующих микроорганизмов. Споры аэробных бацилл, анаэробных клостридий и плесени обычно при копче­нии не погибают. Следовательно, коптильные вещества играют второсте­пенную роль в подавлении жизнедеятельности микрофлоры фарша. Бактерицидный эффект копчения заключается глав­ным образом в создании бактерицидной зоны на поверхнос­тных участках продукта, защищающей его от проникновения и размножения микроорганизмов извне.

Основная микрофлора сырокопченых и вяленых колбас (молочнокислые бактерии, микрококки, дрожжи) влияют на созревание и формирование специфического запаха, вкуса, цвета и других органолептических свойств продукта.

Для улучшения качества колбасных изделий в отдельных странах применяют некоторые виды бактерий в виде чистой культуры или смеси нескольких видов. В США при выработке сыровяленой колбасы (типа летней) используют культуру Рediococcus cerevisiae. Эту культуру выпускают в сухом виде (пре­парат «Ассеl»). В Германии при изготовлении сырокопченой колба­сы с добавлением селитры применяют культуру микрококка Т-53, которую фирма «Мекл» выпускает под названием «бактофермента».

Некоторые бактериальные культуры (L.plantarum, M.aqwatilis, M.auranticus, Snr.lactis) при добавлении в колбасный фарш, значительно улучшают органолептические и санитарные показатели сыровяленных и сырокопченых колбас.