Электронная библиотека

  • Для связи с нами пишите на admin@kursak.net
    • Обратная связь
  • меню
    • Автореферат (88)
    • Архитектура (159)
    • Астрономия (99)
    • Биология (768)
    • Ветеринарная медицина (59)
    • География (346)
    • Геодезия, геология (240)
    • Законодательство и право (712)
    • Искусство, Культура,Религия (668)
    • История (1 078)
    • Компьютеры, Программирование (413)
    • Литература (408)
    • Математика (177)
    • Медицина (921)
    • Охрана природы, Экология (272)
    • Педагогика (497)
    • Пищевые продукты (82)
    • Политология, Политистория (258)
    • Промышленность и Производство (373)
    • Психология, Общение, Человек (677)
    • Радиоэлектроника (71)
    • Разное (1 245)
    • Сельское хозяйство (428)
    • Социология (321)
    • Таможня, Налоги (174)
    • Физика (182)
    • Философия (411)
    • Химия (413)
    • Экономика и Финансы (839)
    • Экскурсии и туризм (29)

Биотехнология протеомика

3. Протеом – полный набор белков в организме, ткани, клетки, межклеточной жидкости

Белки (протеины, полипептиды) — высокомолекулярные органические вещества, состоящие из альфа-аминокислот, соединённых в цепочку пептидной связью

Протеомика – наука изучающая протеом клетки, организма, ткани и т.д.

  • общая протеомика исследует полный протеом биосистемы
  • селективная нацелена на определенную группу белков (фосфопротеины, гликопротеины…)

4. Протеом – самая динамичная биохимическая система

Высокое биохимическое разнообразие белков в клетке создается благодаря двум основным процессам:

- Алтернативный сплайсинг (удаление интронов в мРНК)

- Посттрансляционная модификация белка (гликозилирование, фосфорилирование, создание четвертичной структуры и т.д.)

- Некоторые белки образуются ферментативно из непосредственных предшественников (глутатион)

5. Благодаря пептидной связи образуется первичная структура белка

Ø Первичная структура белка определяет 3D-конформацию и его функции

Ø Для выполнения своих функций белок должен приобрести третичную структуру

Ø Для приобретения нативной структуры в клетках функционируют шапероны, осуществляющие фолдинг белка

6. Вторичная структура белка образуется благодаря водородным связям между кислородом карбонильной группы и водородом иминогруппы в самой полипептидной цепи

Третичная структура образуются благодаря водородным, ковалентным (дисульфидным), гидрофобным, ван-дер-ваальсовым связям между радикалами полипептида

8. Необходимость изучения протеома

Ø Не все гены кодируют белки

Ø Не все транскрипты преобразуются в функциональный белок

Ø Наличие посттрансляционной модификации значительно увеличивает количество белков в клетке по сравнению с транскриптами

Ø Протеом – наиболее полная динамическая структура, показывающая функциональные изменения в клетке

Ø Анализ протеома необходим для полной интерпретации функции генов

Особенности изучения протеома:

Ø Невозможность амплификации

Ø Несоответствие заряда молекулы белка его молекулярному весу

Ø Наличие сложных белков с простетическими группами, а также модифицированных АМК (например, селеноцистеин)

Ø Для понимания функции белка необходимо установить 3D-структуру

9. Стратегии в протеомике

Этапы анализа протеома:

  1. Подготовка образца для анализа
  2. Разделение белков
  3. Идентификация
  4. Поиск в базе данных
  5. Обработка данных (биоинформатика)

10. Подготовка образца для анализа

1. Для экстрагирования белков из клеток необходимо разрушить клеточные компартменты, это достигается:

Ø Механическим разрушением (ультразвук, french pressure cell press)

Ø Химический лизис

2. Полученные белки необходимо перевести в растворимую форму, это достигается помощью SDS (sodium dodecyl sulfate)

3. Фракционирование необходимо для очистки образца от разрушенных компонентов клеток, липидов, полинуклеотидов и полисахаридов (дифференциальное центрифугирование, ультрацентрифугирование)

11. Разделение белков методом 2D гель электрофореза

Изоэлектрическая точка белка – это значение pH, при котором суммарный заряд белка равен 0

Белок состоит из катионогенных (лизин, аргинин, гистидин) и анионогенных (аспартат и глутамат) аминокислот, их соотношение определяет суммарный заряд белка

1 стадия 2D гель электрофореза заключается в разделении белков в зависимости от их изоэлектрической точки

12. На первом этапе белки движутся в градиенте pH от 1 до 14 в электрическом поле, при достижении точки, в которой pH соответствует pI, белок останавливается (этот прием называется изоэлектрическое фокусирование – IEF).

Перед проведением 2 этапа к белкам добавляют SDS для полной денатурации и создания отрицательного заряда на молекуле белка, т. о. мы добиваемся примерно одинакового отношения заряда к массе.

Во втором измерении, электрический потенциал прикладывают снова, но под углом 90 градусов к первой области. Белки будут распределяться в зависимости от величины их отрицательного заряда, вызванного присоединением SDS

13. Дифференциальный анализ протеома

Анализ протеома в двух различных физиологических состояниях организма

Идентификация белков

Ø использование белковых микрочипов (без использования предварительного разделения белков)

Ø анализ последовательности аминокислот в белках и последующий поиск в базах данных

14. Bottom-up протеомика

Ø Следующий шаг ферментативное расщепление белков непосредственно в геле. Широко используется трипсин, расщепляющий пептидную связь между Lys и Arg

Ø Затем фрагменты белка разделяют с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), которая соединена с MS (масс-спектрографом, который определяет аминокислотный состав)

Ø Для идентификации белка применяется биоинформатические методы и поиск последовательности в базах данных уже известных секвенсов

Ø Идентифицируется обычно около 40% протеома

15. Top-down протеомика

Ø В данном подходе не используется ферментативное расщепление, непосредственно анализируется белок с 2DE

Ø Требует высокую степень разделения и очистки белков, а также высокую разрешающую способность масс-спектрографа

Ø Фрагментирование белков происходит в самом MS, при таком подходе используется тандемный масс-спектрограф

Ø Потенциально можно проанализировать весь протеом

16. Масс спектрометрия

Масс спектрометр состоит из 4 основных элементов:

Ø Система введения анализируемого образца

Ø Ионный источник

Ø Масс анализатор

Ø Детектор

Принцип работы: определение соотношения массы иона (m) к его заряду (q)

17. Ионный источник

Ионизация электроспреем (ESI)

Ø Жидкий образец распыляется в электрическом поле между распылительным кончиком и входом в MS

Ø Позволяет анализировать крупные молекулы до 200 кДа

Ø Легко комбинируется с жидкостным хроматографом (ВЭЖХ) – LС-ESI-MS

Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)

Ø Ионизирует образец в твердой фазе

Ø На металлическую пластинку наносится матрикс (2,5-дигидроксибензойная кислота – DHB или производные циннамовой кислоты) с анализируемым веществом

Ø Под действием УФ лазера молекулы ионизируются и под действием электрического поля перемещаются к МA

Ø Комбинирование с LС проблематично

18. Тандемная масс спектрометрия

Соединяет два масс анализатора в один инструмент:

Ø Первый MS (квадруполь) помогает разделить ионы, поступающие из ионного источника

Ø Затем селектированные ионы фрагментируются посредством столкновения с молекулами инертного газа в ячейке соударений

Ø Фрагментированные (дочерние) ионы разделяются с помощью второго MS имеющего высокую разрешающую способность

Ø Тандемная масс-спектрометрия ключевая техника в идентификации белковых молекул в bottom-up протеомике

Ø Тандемный MS для top-down протеомики включает масс анализаторы с высокой разрешающей способностью (время-пролетный масс анализатор TOF): MALDI TOF TOF MS

19. Наиболее распространенная фрагментация – расщепление пептидной связи между атомами углерода и азота, в результате образуются 2 типа ионов: b-ионы и y-ионы

20. Определение 3D структуры белка

Третичная структура связана с функцией белка

Определение вторичной, третичной и четвертичной структуры включает

Ø Рентгеноструктурный анализ (X-ray crystallography)

Ø Белковый ядерно-магнитный резонанс (protein NMR)

Для анализа используют только очищенные и сконцентрированные белки

Для изображения трехмерной структуры белка используется ленточная диаграмма

Тема необъятна, читайте еще:

  1. «Сельскохозяйственная биотехнология»
  2. Биотехнология. История и достижения
  3. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ КЛЕТКИ
  4. Фоторезистивный эффект

Автор: Наташа, 11.04.2015
Рубрики: Сельское хозяйство
Предыдущие записи: Дрожжи в биотехнологии
Следующие записи: Введения в биотехнологию

Последние статьи

  • ТОП -5 Лучших машинок для стрижки животных
  • Лучшие модели телескопов стоимостью до 100 долларов
  • ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ ОТКЛОНЕНИЙ РЕЧЕВОГО РАЗВИТИЯ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА
  • КОНЦЕПЦИИ РАЗВИТИЯ И ПОЗИЦИОНИРОВАНИЯ СИБИРИ: ГЕОПОЛИТИЧЕСКИЕИ ГЕОЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОЦЕНКИ
  • «РЕАЛИЗМ В ВЫСШЕМ СМЫСЛЕ» КАК ТВОРЧЕСКИЙ МЕТОД Ф.М. ДОСТОЕВСКОГО
  • Как написать автореферат
  • Реферат по теории организации
  • Анализ проблем сельского хозяйства и животноводства
  • 3.5 Развитие биогазовых технологий в России
  • Биологическая природа образования биогаза
Все права защищены © 2015 Kursak.NET. Электронная библиотека : Если вы автор и считаете, что размещённая книга, нарушает ваши права, напишите нам: admin@kursak.net