3. Протеом – полный набор белков в организме, ткани, клетки, межклеточной жидкости
Белки (протеины, полипептиды) — высокомолекулярные органические вещества, состоящие из альфа-аминокислот, соединённых в цепочку пептидной связью
Протеомика – наука изучающая протеом клетки, организма, ткани и т.д.
- общая протеомика исследует полный протеом биосистемы
- селективная нацелена на определенную группу белков (фосфопротеины, гликопротеины…)
4. Протеом – самая динамичная биохимическая система
Высокое биохимическое разнообразие белков в клетке создается благодаря двум основным процессам:
- Алтернативный сплайсинг (удаление интронов в мРНК)
- Посттрансляционная модификация белка (гликозилирование, фосфорилирование, создание четвертичной структуры и т.д.)
- Некоторые белки образуются ферментативно из непосредственных предшественников (глутатион)
5. Благодаря пептидной связи образуется первичная структура белка
Ø Первичная структура белка определяет 3D-конформацию и его функции
Ø Для выполнения своих функций белок должен приобрести третичную структуру
Ø Для приобретения нативной структуры в клетках функционируют шапероны, осуществляющие фолдинг белка
6. Вторичная структура белка образуется благодаря водородным связям между кислородом карбонильной группы и водородом иминогруппы в самой полипептидной цепи
Третичная структура образуются благодаря водородным, ковалентным (дисульфидным), гидрофобным, ван-дер-ваальсовым связям между радикалами полипептида
8. Необходимость изучения протеома
Ø Не все гены кодируют белки
Ø Не все транскрипты преобразуются в функциональный белок
Ø Наличие посттрансляционной модификации значительно увеличивает количество белков в клетке по сравнению с транскриптами
Ø Протеом – наиболее полная динамическая структура, показывающая функциональные изменения в клетке
Ø Анализ протеома необходим для полной интерпретации функции генов
Особенности изучения протеома:
Ø Невозможность амплификации
Ø Несоответствие заряда молекулы белка его молекулярному весу
Ø Наличие сложных белков с простетическими группами, а также модифицированных АМК (например, селеноцистеин)
Ø Для понимания функции белка необходимо установить 3D-структуру
9. Стратегии в протеомике
Этапы анализа протеома:
- Подготовка образца для анализа
- Разделение белков
- Идентификация
- Поиск в базе данных
- Обработка данных (биоинформатика)
10. Подготовка образца для анализа
1. Для экстрагирования белков из клеток необходимо разрушить клеточные компартменты, это достигается:
Ø Механическим разрушением (ультразвук, french pressure cell press)
Ø Химический лизис
2. Полученные белки необходимо перевести в растворимую форму, это достигается помощью SDS (sodium dodecyl sulfate)
3. Фракционирование необходимо для очистки образца от разрушенных компонентов клеток, липидов, полинуклеотидов и полисахаридов (дифференциальное центрифугирование, ультрацентрифугирование)
11. Разделение белков методом 2D гель электрофореза
Изоэлектрическая точка белка – это значение pH, при котором суммарный заряд белка равен 0
Белок состоит из катионогенных (лизин, аргинин, гистидин) и анионогенных (аспартат и глутамат) аминокислот, их соотношение определяет суммарный заряд белка
1 стадия 2D гель электрофореза заключается в разделении белков в зависимости от их изоэлектрической точки
12. На первом этапе белки движутся в градиенте pH от 1 до 14 в электрическом поле, при достижении точки, в которой pH соответствует pI, белок останавливается (этот прием называется изоэлектрическое фокусирование – IEF).
Перед проведением 2 этапа к белкам добавляют SDS для полной денатурации и создания отрицательного заряда на молекуле белка, т. о. мы добиваемся примерно одинакового отношения заряда к массе.
Во втором измерении, электрический потенциал прикладывают снова, но под углом 90 градусов к первой области. Белки будут распределяться в зависимости от величины их отрицательного заряда, вызванного присоединением SDS
13. Дифференциальный анализ протеома
Анализ протеома в двух различных физиологических состояниях организма
Идентификация белков
Ø использование белковых микрочипов (без использования предварительного разделения белков)
Ø анализ последовательности аминокислот в белках и последующий поиск в базах данных
14. Bottom-up протеомика
Ø Следующий шаг ферментативное расщепление белков непосредственно в геле. Широко используется трипсин, расщепляющий пептидную связь между Lys и Arg
Ø Затем фрагменты белка разделяют с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), которая соединена с MS (масс-спектрографом, который определяет аминокислотный состав)
Ø Для идентификации белка применяется биоинформатические методы и поиск последовательности в базах данных уже известных секвенсов
Ø Идентифицируется обычно около 40% протеома
15. Top-down протеомика
Ø В данном подходе не используется ферментативное расщепление, непосредственно анализируется белок с 2DE
Ø Требует высокую степень разделения и очистки белков, а также высокую разрешающую способность масс-спектрографа
Ø Фрагментирование белков происходит в самом MS, при таком подходе используется тандемный масс-спектрограф
Ø Потенциально можно проанализировать весь протеом
16. Масс спектрометрия
Масс спектрометр состоит из 4 основных элементов:
Ø Система введения анализируемого образца
Ø Ионный источник
Ø Масс анализатор
Ø Детектор
Принцип работы: определение соотношения массы иона (m) к его заряду (q)
17. Ионный источник
Ионизация электроспреем (ESI)
Ø Жидкий образец распыляется в электрическом поле между распылительным кончиком и входом в MS
Ø Позволяет анализировать крупные молекулы до 200 кДа
Ø Легко комбинируется с жидкостным хроматографом (ВЭЖХ) – LС-ESI-MS
Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)
Ø Ионизирует образец в твердой фазе
Ø На металлическую пластинку наносится матрикс (2,5-дигидроксибензойная кислота – DHB или производные циннамовой кислоты) с анализируемым веществом
Ø Под действием УФ лазера молекулы ионизируются и под действием электрического поля перемещаются к МA
Ø Комбинирование с LС проблематично
18. Тандемная масс спектрометрия
Соединяет два масс анализатора в один инструмент:
Ø Первый MS (квадруполь) помогает разделить ионы, поступающие из ионного источника
Ø Затем селектированные ионы фрагментируются посредством столкновения с молекулами инертного газа в ячейке соударений
Ø Фрагментированные (дочерние) ионы разделяются с помощью второго MS имеющего высокую разрешающую способность
Ø Тандемная масс-спектрометрия ключевая техника в идентификации белковых молекул в bottom-up протеомике
Ø Тандемный MS для top-down протеомики включает масс анализаторы с высокой разрешающей способностью (время-пролетный масс анализатор TOF): MALDI TOF TOF MS
19. Наиболее распространенная фрагментация – расщепление пептидной связи между атомами углерода и азота, в результате образуются 2 типа ионов: b-ионы и y-ионы
20. Определение 3D структуры белка
Третичная структура связана с функцией белка
Определение вторичной, третичной и четвертичной структуры включает
Ø Рентгеноструктурный анализ (X-ray crystallography)
Ø Белковый ядерно-магнитный резонанс (protein NMR)
Для анализа используют только очищенные и сконцентрированные белки
Для изображения трехмерной структуры белка используется ленточная диаграмма